土壤中纤维素降解菌的筛选鉴定及其糖化水平

张海艳，路青青，杨伟平

(洛阳师范学院 生命科学学院，河南 洛阳 471934)

纤维素资源是地球上最丰富和廉价的可再生资源，包括农作物秸秆、园林废弃物、甘蔗渣及工业纤维废渣等[1]。全世界通过光合作用产生的纤维素估计为1.55×109t/a，其中约89%尚未被利用[2]。我国的纤维素资源丰富，数量巨大，但由于纤维素难以降解，所以目前对其开发和利用非常有限，主要用于燃料、畜牧饲料与积肥，导致纤维素资源利用率很低，且造成环境污染[1-4]。产纤维素酶的微生物可将天然纤维素分解为葡萄糖等可利用的物质，对解决污染、能源危机等问题，保障人类社会可持续发展具有重大意义[5-6]。因此，筛选产高活性纤维素酶的菌株，是开发利用纤维素资源的前提和关键。产纤维素酶微生物广泛存在于土壤、极地海洋、温泉、植物组织、动物体内及真菌等生物样品和环境中，其中，土壤中纤维素分解菌最多[7-8]。何楠等[9-16]对不同土壤中纤维素降解菌进行分离、鉴定，并对其产酶活性进行研究；周晨妍等[17-18]对产纤维素酶菌株发酵条件进行优化研究。

为了提高纤维资源的有效利用，开发纤维素降解菌剂，采用刚果红染色法从河南省栾川县龙峪湾森林公园腐殖质土样中分离筛选产纤维素酶菌株，经16S rRNA分子鉴定后，对其糖化水平和产酶活力进行研究，旨在为丰富降解纤维素微生物资源，更好地利用纤维素资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 土样采集 从龙峪湾国家森林公园采集腐殖土样，4℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 3，5-二硝基水杨酸、重蒸酚、羧甲基纤维素钠、柠檬酸及柠檬酸钠等。

1.1.3 培养基 羧甲基纤维素(CMC)培养基、LB培养基、产酶培养基、滤纸条培养基，均参照文献[10，19]配制。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理 将土壤样品按10-6～10-2梯度用无菌蒸馏水稀释备用。

1.2.2 纤维素降解菌的分离筛选

1)初筛。取100 μL稀释液涂布于CMC平板上，37℃培养24 h，挑选繁殖状况好的菌落，加入1 mg/mL刚果红染液，覆盖菌落12 min后吸去刚果红染液，再加入NaCl溶液漂洗，观察透明圈大小，保留圈大的菌落，即完成初步筛选。

2)纯化培养。在超净工作台用灭过菌的接种环挑取初步筛选得到的少许菌落，接种至LB培养基中摇床培养12 h，用三线法在CMC培养基上纯化，37℃培养24 h，完成第1次纯化培养，重复上述步骤培养4～5次。

3)复筛。在CMC培养基上点种，向培养基中倒入刚果红染液，静置12 min左右，NaCl溶液漂洗，并根据透明圈直径和菌落直径大小选择优质菌株。

1.2.3 滤纸降解测定 向滤纸条培养基中加1 mL菌液，滤纸大小为5 cm×1 cm，摇床培养1～12 d，每天定时观察滤纸的崩解情况[16]。

1.2.4 糖化水平测定 葡萄糖(还原糖)测定采用DNS显色法[20]。调整菌株浓度的OD540为0.5，然后以1∶100的比例接种到产酶培养基上制备粗酶液。粗酶液和缓冲液中的碳源充分反应后，煮沸灭活，在室温下测OD540值，计算菌株的产糖量。

1.2.5 酶活力测定 将pH 4.8，50℃条件下1 min内将底物转化为1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U/mL)[21]。酶活力的计算公式：

X=[(A1-A2)×K+c]/(M×t)×1000

式中，X为CMCase活力，A1为OD540值，A2为对照OD540值，K为斜率，c为截距，M为葡萄糖的分子量，t为时间。

1.2.6 分离菌株鉴定

1)形态学鉴定。观察细菌在CMC培养基上的生长状况，包括形状、形态、透明度、颜色及菌落质地等。

2)革兰氏染色。参照宁俊平[22]的方法，通过革兰氏染色对菌体进行形态学鉴定。

3)分子鉴定。通过CTAB法[23]和溶菌酶[21]相结合提取细菌基因组DNA。将提取的基因组DNA作为模板，PCR扩增菌株的16S rRNA基因[24]。所得扩增后产物由北京中科希林生物科技公司测序。将测序结果在NCBI浏览器上用BLAST 程序进行同源性分析，用Mega 7.0.26中的neighbor-joining法构建菌株的系统发育树。

1.2.7 菌种的生长特性 调整菌液OD600=0.5作为种子液。以1∶100的比例接种至LB培养基中，每隔4 h测其OD600，并用PBS缓冲溶液做对照，记录菌比体的生长情况并绘制菌丝体的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的筛选

从表1和图1看出，反复划线培养4～5次，经刚果红染色，筛选出7株透明圈较明显的菌株，将其分别编号为LY-1、LY-2、LY-3、LY-4、LY-5、LY-6和LY-7。点种复筛后，各菌株在CMC培养基上的菌落直径(d)与降解圈直径(D)比的大小依次为LY-5>LY-6>LY-3>LY-1>LY-7>LY-4>LY-2。其中，菌株LY-1、LY-3、LY-5和LY-6的透明圈直径比较大，可用于后续试验。

表1 纤维素降解菌株的菌落与降解圈直径Table 1 Colony and degradation circle diameter of cellulose-degrading strain

图1纤维素降解菌株 LY-1、LY-3、LY-5和 LY-6刚果红染色
Fig.1 Congo red staining of cellulose-degrading strains LY-1,LY-3,LY-5 and LY-6

2.2 分离菌株对滤纸条的降解

将菌株LY-1、LY-3、LY-5和LY-6进行滤纸条降解试验，结果表明，菌株LY-1和LY-5处理的溶液变浑浊，滤纸条接近糊状，菌株LY-6处理的滤纸条成糊状，菌株LY-3处理的滤纸条几乎不降解。

2.3 分离菌株的糖化水平与酶活力

由图2可见分离菌株的糖化水平与酶活力。1)糖化水平。4株菌株的糖化水平依次为LY-6>LY-1>LY-5>LY-3，其中，菌株LY-6产糖量最高，为0.045 mg/mL；其次是菌株LY-1，产糖量为0.035 mg/mL；菌株LY-3产糖量最低，为0.021 mg/mL。2)酶活力。4株菌株产纤维素酶的活力存在差异，其酶活力依次为LY-6>LY-1>LY-5>LY-3，其中，菌株LY-6的酶活力最高，为0.004 8 U/mL；菌株LY-3的酶活力最低，仅为0.001 3 U/mL。选择菌株LY-6进行鉴定。

图2 纤维素降解菌 4个菌株的糖化水平与酶活力Fig.2 Saccharification level and enzyme activity of the four cellulose-degrading strains

2.4 菌株 LY-6的鉴定

2.4.1 形态学鉴定 从图3可见，菌株LY-6的菌落呈近圆形，较小，不透明，表面光滑，呈乳白色，革兰氏染色呈阳性，有芽孢。根据《常见细菌系统鉴定手册》[25]初步鉴定LY-6为芽孢杆菌属的细菌。

图3 纤维素降解菌株 LY-6的菌落形态Fig.3 Colony morphology of cellulose-degrading strain LY-6

2.4.2 菌株LY-6的16S rRNA基因序列分析 对提取基因组DNA进行PCR扩增，发现目的条带大小为1 500 bp左右(图4)。将基因序列在NCBI分析结果显示，菌株LY-6的16S rRNA基因序列长度为1 183 bp，其与多株芽孢杆菌属的16S rRNA基因序列的相似性高达97%。从Mega 7.0.26构建的菌株LY-6系统进化树(图5)看，该菌株与BacillussafensisstrainNBRC 100820的亲缘关系最近，相似性为99%，由此可确定菌株LY-6为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)，命名为BacillussafensisLY-6。

图4 纤维素降解菌株 LY-6的PCR 产物电泳图Fig.4 Polymerase chain reaction product electrophoresis of cellulose-degrading strain LY-6

2.5 菌株 LY-6的生长曲线

由图6可知，BacillussafensisLY-6在培养4～16 h内，菌株的生长速率快，呈指数增长。在培养16～20 h内，B.safensisLY-6处于稳定期，OD600值最高可达0.804。24 h后菌株数量开始下降。

图5 纤维素降解菌株LY-6 16S rRNA 基因序列的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of LY-6 16S rRNA gene sequence of cellulose-degrading strain

图6 纤维素降解菌株 LY-6的生长曲线Fig.6 Growth curve of cellulose-degrading strain LY-6

3 结论与讨论

从落叶腐殖质土样中分离筛选出的7株产纤维素酶菌株中，菌株LY-6的产酶特性最强，经鉴定，该菌株为沙福芽孢杆菌(BacillussafensisLY-6)。该菌株在培养16～20 h内生长比较稳定，OD600值最高可达0.804。刚果红染色LY-6菌株在CMC培养基上的透明圈直径为1.40 cm，较明显，该菌株的产糖量和产纤维素酶的活力分别为0.045 mg/mL和0.004 8 U/mL。

目前，真菌和细菌是分解纤维素的主要微生物。真菌通过胞外游离纤维素酶起作用，而细菌通过形成多酶复合体结构起作用[26-28]。与真菌相比，细菌有生长速度较快、发酵时间短及产纤维素酶更容易获得的优点。顾挺等[29]从种稻红壤筛选出枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌；李洁等[15]从种竹林地红壤筛选出1株芽孢杆菌；不同菌株适宜不同类型的土壤[9-16]，该研究筛选出的沙福芽孢杆菌来自落叶丰富的腐殖质土壤。

当代社会生态问题极其重要，纤维素是巨大的可再生资源，利用微生物分解纤维素资源，实现生物量的转化和利用，有利于社会的可持续发展。纤维素酶在工业、食品、医药方面均有很大的应用潜力[30-31]。该研究筛选的BacillussafensisLY-6属沙福芽孢杆菌，其可以直接降解纤维蛋白，并且对血栓中的纤维蛋白有一定的降解特异性，对于口服溶栓药的开发具有重要意义[30]。沙福芽孢杆菌纤溶酶活性较好，具有潜在开发价值。