云南核桃无融合生殖率和果实生长量研究

熊利权 宁德鲁 石卓功 肖良俊 吴 涛 杨从华

( 1. 西南林业大学林学院，云南 昆明 650233；2. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201)

核桃（Juglans regia）又名胡桃、羌桃，是我国重要的栽培经济林树种，属胡桃科（Juglandaceae）胡桃属（Juglans）多年生高大落叶乔木[1-2]。云南核桃以深纹核桃为主，因有得天独厚的自然条件和悠久的栽培历史，云南核桃种类多、品种杂，构成了多样、复杂的核桃种质资源体系[3-4]。

核桃具有一定的无融合生殖能力，在不经过精卵受精结合的情况下就能繁殖后代，也叫孤雌生殖[5-6]。核桃的无融合生殖，能有效利用其杂种优势，使子代的遗传特性得以纯化，保持母本的优良性状，对现有品种复壮、选育矮化砧、减少配置授粉树等具有很大作用，且能协助有性生殖，提高坐果率，增加产量[7-8]。国内外许多学者对核桃的无融合生殖都做过研究，Bekir等[9]用9年的时间观察表明中欧38个核桃品种中18.5%的品种具有孤雌生殖能力；1963年，河北农业大学对核桃进行去雄套带隔离的方法，观察到坐果率为1.2%，1983年，在河北省涉县观察到核桃孤雌生殖率为4.08%～43.7%[10-11]；杜蕊等[12]、宁万军等[13]、李迎超[14]、高绍棠等[15]采用去雄套袋、聚乙烯醇封柱头、药剂处理柱头、切除柱头等方法，都表明核桃具有无融合生殖能力，且采用不同的处理方法其无融合生殖坐果率也不同。目前，对云南核桃无融合生殖的研究甚少。本研究通过对云南核桃实施不同的无融合生殖处理，测定其无融合生殖率和果实生长量，为云南核桃优良品种遗传特性纯化提供基础，同时为提高坐果率、增加产量、选育矮化砧等生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

漾濞泡核桃和娘青核桃为云南传统栽培深纹核桃品种，采自云南省大理州漾濞县平坡镇高发村（北纬 25°32′，东经 99°57′），海拔 2 010 m，年平均气温14.2 ℃，年降水量935.1 mm，土壤类型黄棕壤。云新301和云新303，为深纹核桃与普通核桃杂交种，采自云南省林业科学院昆明树木园（北纬 25°08′，东经 102°45′），海拔 1 970 m，年平均气温14.7 ℃，年降水量1 100 mm，土壤类型红壤[16]。树体生长健壮，15年生，常规管理。

1.2 试验方法

1.2.1 预处理

于2018年2月，雌花柱头显露时，去掉雄花序，采取套硫酸纸袋的方法，以自然授粉为CK，每个品种套150个纸袋，每个纸袋套2～5个雌花。挂牌标记。雌花柱头显露时，切除柱头，每个品种切除150个结果枝的雌花柱头，每个结果枝2～5个雌花，挂牌标记。

1.2.2 坐果数、无融合生殖率计算方法

统计各品种的去雄套袋组、切柱头组、CK的原始雌花数。去雄套袋组雌花柱头萎蔫后去除纸袋。在第1次生理落果后统计各品种各个组的雌花坐果数；果实成熟时统计各品种各个组的果实数量。按公式（1）～（2）计算坐果率和无融合生殖率。

1.2.3 花粉管生长情况观测方法

从试验处理开始，每个处理组每天采样1次，每次采样3～4个雌花，直至雄花凋落完毕、雌花柱头萎蔫。3个处理组都将整个雌花作为观测材料，其中CK和去雄套袋组带柱头一起观测，切柱头组观测子房部分。将所选材料经过FPA70固定液固定，置于冲洗瓶中冲洗8 h，加入8 mol/L NaOH浸泡15 h，苯胺蓝染色10 h，在载玻片上压制材料后放在ZLDF-KY2倒置荧光显微镜（上海奋业光电仪器设备有限公司，中国）下观察子房内是否有花粉管生长或柱头上是否有花粉萌发[17]。

1.2.4 无融合生殖果实生长量测定方法

在幼果生长期，每6 d采样1次；在坐果稳定后，每15～20 d采样1次。每个品种的每个处理每次采6～8个幼果，测其纵径、横径、棱径和质量，观察果实生长情况。在果实生长过程中，对坐果时期进行统计，观测物候期。有20%的雄花序基部小花开始分裂时为雄花始期；有20%的雌花显现时为雌花始期；雌花柱头刚绽放时为雌花柱头显露期，此时进行无融合生殖处理（去雄套袋、切柱头）；幼果在非病虫害等外界破坏下大量脱落时为生理落果期；果实生长稳定时为稳果期。

1.3 数据分析

用Excel 2007对数据进行整理统计，Origin软件作图，SPSS 17.0软件对数据进行多重比较分析处理。

2 结果与分析

2.1 云南核桃无融合生殖果实坐果时期

由表1可知，4个核桃品种均为雄先型植株。云新301的花期最早，3月3日就有雄花出现，3月5日雌花也逐渐出现；其次是云新303，较云新301晚1周左右；漾濞泡核桃3月16日雄花出现，3月25日雌花出现；娘青核桃的物候期最晚，到3月底才有雌、雄花出现，较漾濞泡核桃晚6～7 d。4个品种的无融合生殖处理时间规律基本相同，在雌花出现1周左右（雌花柱头刚刚显露时）进行去雄套袋和切柱头的无融合生殖处理，套袋组在套袋后20 d左右去袋（此时柱头萎蔫）；去雄套袋和切柱头处理后25～30 d出现生理大落果，再经过4～6 d进入稳果期，其中套袋组比切柱头组要晚1～2 d，CK较无融合生殖处理组早2～4 d。

表 1 云南核桃2018年无融合生殖物候期Table 1 Apomixis phenology of J. regia in 2018

可见，云南核桃无融合生殖处理后，其果实发育各个时期均晚于CK。在去雄套袋和切除柱头处理后，切除柱头处理的物候期稍早于去雄套袋处理1～2 d，说明切除柱头处理的坐果期更早，有利于无融合生殖果实的发育。

2.2 云南核桃无融合生殖率测定

由表2可知，在4个供试品种中，漾濞泡核桃、娘青核桃的自然坐果率为58.85%、57.67%，杂交品种云新301、云新303的自然坐果率为64.67%、72.89%；漾濞泡核桃、娘青核桃、云新301和云新303的无融合生殖率分别为2.77%～37.11%、4.63%～44.89%、6.8%～10.04%和3.79%～7.28%。从整体看，传统栽培品种漾濞泡核桃、娘青核桃的无融合生殖率高于杂交品种云新301、云新303。可见，杂交核桃品种云新301、云新303的自然坐果率高于传统栽培品种漾濞泡核桃、娘青核桃，无融合生殖率却低于传统栽培品种漾濞泡核桃、娘青核桃，其中，娘青核桃的无融合生殖率最高，云新303的无融合生殖率最低。

从4个供试品种来看，切柱头的无融合生殖处理组的无融合生殖率高于去雄套袋组。漾濞泡核桃切柱头组的无融合生殖率为37.11%，而去雄套袋组仅为2.77%；娘青核桃切柱头组的无融合生殖率为44.89%，去雄套袋组仅为4.63%；云新303切柱头组的无融合生殖率为7.28%，去雄套袋组为3.79%；云新301去雄套袋组的无融合生殖率为6.8%，是4个供试品种中最高的，但其切柱头组的无融合生殖率为10.04%，还是高于去雄套袋组。4个供试品种中，无融合生殖坐果率与自然授粉坐果率差异显著（P＜0.05），无融合生殖处理中去雄套袋处理的无融合生殖率与切柱头处理的无融合生殖率差异显著（P＜0.05）。

综合上述分析表明，云南核桃的无融合生殖率为2.77%～44.89%，其中云南传统栽培品种的无融合生殖率高于杂交品种的无融合生殖率，分别为2.77%～44.89%和3.79%～10.04%。针对云南核桃不同的无融合生殖处理其无融合生殖率有显著差异（P＜0.05），切除柱头的无融合生殖率可达7.28%～44.89%，而去雄套袋的无融合生殖率仅为2.77%～6.8%，切柱头处理的无融合生殖率高于去雄套袋处理。

表 2 云南核桃无融合生殖率差异分析Table 2 Difference analysis of apomictic rate of J. regia

2.3 授粉情况及花粉管检测结果

为了验证无融合生殖的准确性，对所试品种不同无融合生殖处理的授粉情况及花粉管生长情况进行了检测。如图1所示，图1a为CK的荧光观测情况，在图中箭头所指为花粉管和花粉粒，可明显观测到柱头上的花粉粒和花粉管生长；图1b和图1c为无融合生殖处理组的荧光观测情况，其中图1b为去雄套袋组，图1c为切柱头组，在图中均未观察到花粉粒和花粉管。

图 1 不同处理子房或柱头内花粉粒和花粉管分布情况Fig. 1 Distribution of pollen grains and pollen tubes in different treatment ovaries or stigma

CK的雌花在经过授粉受精后，花粉粒在柱头顶端萌发，从而在柱头和子房内有花粉管生长；无融合生殖处理的雌花通过去雄套袋、切柱头后，不经过授粉受精，因此柱头和子房内无花粉管分布。

2.4 云南核桃无融合生殖果实生长量测定结果

2.4.1 云南核桃无融合生殖果实大小

由图2可知，在去雄套袋、切除柱头和自然授粉3个处理中，果实大小的生长有一定的差异，其中自然授粉的果实生长最快，切除柱头处理与自然授粉接近，而去雄套袋的果实生长最慢。从图中折线走势看，到稳果后果实大小生长开始加速，直到硬果期，各个处理的果实大小逐渐接近，趋于稳定。

2.4.2 云南核桃无融合生殖果实质量

由图3可知，在去雄套袋、切除柱头和自然授粉3个处理中，果实质量的增长有一定的差异，其中自然授粉的果实重量增长最快，切除柱头处理次之，去雄套袋处理的果实增长最慢。从图中折线走势看，在坐果稳定后，果实质量增长加快，呈加速上升趋势，说明此阶段为核桃内含物增长的关键时期。

图 2 云南核桃2018年无融合生殖果实大小生长情况Fig. 2 Apomictic fruit size growth of J. regia， 2018

图 3 云南核桃无融合生殖果实质量增长情况Fig. 3 Apomictic fruit weight growth of J. regia

综合图2、图3可知，不同处理的云南核桃无融合生殖果实生长量有很大差异。其中，切除柱头处理的无融合生殖果实生长较快，与自然授粉组基本一致，而去雄套袋处理果实生长相对缓慢。说明无融合生殖处理对果实生长有一定的影响，尤其是去雄套袋处理，果实生长迟缓。因此，选择合适的无融合生殖处理方法对果实正常生长很重要。

3 结论与讨论

云南核桃的无融合生殖率为2.77%～44.89%，其中云南传统栽培品种的无融合生殖率高于杂交品种的无融合生殖率，分别为2.77%～44.89%和3.79%～10.04%。不同的无融合生殖处理其无融合生殖率有显著差异，切除柱头的无融合生殖率可达7.28%～44.89%，而去雄套袋的无融合生殖率仅为2.77%～6.8%。无融合生殖的果实发育晚于自然授粉，无融合生殖处理方式不同，其果实生长规律也有所差异。

云南核桃无融合生殖率受无融合生殖处理方式的影响，切柱头处理的无融合生殖率高于去雄套袋处理，这与宁万军等[13]的研究结果一致。去雄套袋处理在套袋期间阻隔了雌花与外界的接触，减少了阳光、空气等对雌花发育、枝梢生长的作用，在一定程度上对树体的正常生长发育有影响；而切柱头处理除了隔绝雌花柱头授粉受精外，对外界环境与树体之间的相互作用毫无影响，相对是一种理想的无融合生殖处理方式。

本研究根据核桃品种特性，针对不同的品种选择最佳的适宜区域进行实验，其中娘青核桃为云南传统栽培品种中的一种农家品种，适宜于高海拔地区，在漾濞县海拔2 000 m左右的山区表现良好[18]；而云新301和云新303是云南省培育的早实新品种，是云南大姚三台核桃为母本、新疆核桃新早13号为父本的种间杂交品种，在滇中一带表现良好[19-20]。张强等[21]通过对新疆2个主栽核桃品种的无融合生殖研究，表明其无融合生殖率为17.8%～58.8%，王国安等[10]对新疆核桃进行研究后报道，无融合生殖率达8.17%～69.44%，而本研究云新系列核桃的无融合生殖率仅为3.79%～10.04%，出现这一差异的原因是否为杂交后生殖生理特性发生变化，或是环境因素造成，还有待进一步研究。

无融合生殖处理方法很多，最常用的为去雄套袋隔离，也可以采取切除柱头、药剂处理、花粉蒙导等方法，目的就是隔绝授粉受精，产生无融合生殖纯合体。对于无融合生殖率的计算，许多学者有不同的方法，王国安等[10]、张强等[21]用去雄套袋后的结果数与套袋雌花总数的比值作为无融合生殖率；张鹏飞[5]、张美勇等[22]先用去雄套袋后的结果数比上套袋雌花数，再用这个比值比上自然授粉坐果率，最终所得的比值作为无融合生殖率。核桃具有一定的无融合生殖能力，在自然授粉的果实中也包含了部分无融合生殖胚形成的果实，所以在计算无融合生殖率时应理解为无融合生殖胚所形成的果实占自然授粉条件下形成的全部果实的百分率。因此，前者应为核桃无融合生殖坐果率，后者为无融合生殖率。

云南核桃无融合生殖处理后，其果实发育晚于自然授粉，不同处理的无融合生殖果实生长量有很大差异。说明无融合生殖处理对果实生长发育有一定的影响，切除柱头处理后的果实生长与自然授粉基本一致，去雄套袋处理的果实生长有所迟缓。选择合适的无融合生殖处理方法对提高无融合生殖率、促进果实正常生长发育具有实际应用价值。