河南地区EICU革兰阴性菌感染的分布及耐药性、耐药基因分析

荆 楠，闫文娟，楚亚菲，马 冰，马 琼，李 轶

急诊重症监护病房(emergency intensive care unit, EICU)是感染的高发科室，由于患者病情危重、病因复杂、免疫力低、接受有创操作较多且大量应用抗生素，细菌分布和耐药情况不同于其他病房。因此，了解特定病原菌分布尤其是不同标本中的分布及耐药性情况显得尤为重要。研究表明，EICU感染病原菌多为革兰阴性杆菌[1]，而目前基于标本类型及耐药基因分析EICU感染革兰阴性菌分布及耐药性的报道较少。本研究对河南地区4家医院2014年1月至2017年12月EICU发生感染患者的送检标本中分离出的革兰阴性菌的分布、耐药性及耐药基因进行回顾性分析，为临床合理应用抗菌药物、医院感染的预防控制提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料来自2014年1月至2017年12月河南地区4家医院，包括河南省人民医院、平顶山市第二人民医院、新乡市第二人民医院、驻马店市中心医院EICU的感染患者共1 904例，年龄18～93(52.33±5.84)岁。从送检的各类标本中培养分离出非重复病原菌1 240株，其中革兰阴性杆菌828株。分离出的828株革兰阴性菌中，河南省人民医院427株，平顶山市第二人民医院110株，新乡市第二人民医院132株，驻马店市中心医院159株。入选菌株标准为首次入住EICU的临床诊断为感染患者的标本中培养出的细菌，同一病人同一标本类型培养出的相同菌株除首次培养外均剔除。

1.2 方法严格参照《全国临床检验操作规程》第4版规定进行培养，分离病原菌；细菌鉴定采用美国BD Phonix100，法国梅里埃VITEC 2 Compact，珠海美华MA120型细菌鉴定仪；药物敏感试验采用纸片法、MIC法或E-test法。试验方法与判定标准按美国临床实验室标准化研究所(clinical and laboratory standards institute, CLSI)2017年版的规定。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212等，均由原卫生部临床检验中心提供。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapene-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)的耐药基因blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaVIM和blaOXA-48。

1.3 CRKP耐药基因检测对感染患者首次检测出的非重复CRKP进行基因扩增。加热煮沸法提取细菌DNA，扩增的碳青霉烯酶基因包括blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaOXA-48和blaVIM。反应体系依照Fermentas公司推荐条件进行。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，Goldview 1型染色剂染色后观察结果。PCR扩增引物见表1。

表1 PCR扩增引物

1.4 统计分析使用WHONET 5.6软件进行药物敏感性结果的统计分析。应用SPSS 19.0统计软件对计数资料进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本来源及病原菌分布从EICU感染患者送检的标本中共分离出病原菌1 240株，其中革兰阴性杆菌最多，共828株，占66.77%。检出革兰阴性杆菌的标本来源中，痰及灌洗液比例最高(61.11%，506/828)，其次依次为血液(14.73%，122/828)；尿液(5.31%，44/828)；无菌体液(5.07%，42/828)；伤口分泌物(4.47%，37/828)及其他(9.30%，77/828)。革兰阴性菌中前5位分离株依次为鲍曼不动杆菌(33.82%，280/828)；肺炎克雷伯菌(24.15%，200/828)；大肠埃希菌(13.04%，108/828)；铜绿假单胞菌(9.06%，75/828)；洋葱伯克霍尔德菌(6.04%，50/828)。下呼吸道标本中首位分离株为鲍曼不动杆菌，而血液标本中病原菌以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主，尿液标本中大肠埃希菌占大多数，见表2。

2.2 革兰阴性菌耐药率非发酵菌中鲍曼不动杆菌除对替加环素、多黏菌素B耐药率较低外，对其他药物的耐药率均很高；铜绿假单胞菌对多数抗菌药物如阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶等表现出较好的敏感性；洋葱伯克霍尔德菌对头孢他啶、氯霉素和复方新诺明耐药率低。肠杆菌科细菌对青霉素类、一代头孢菌素、喹诺酮类抗生素的耐药率较高，均超过55%。大肠埃希菌对阿米卡星、亚胺培南、美罗培南、替加环素及多黏菌素B敏感性较高。肺炎克雷伯菌对美罗培南、亚胺培南的耐药率分别达到39.00%和37.50%，对头孢菌素类抗生素耐药率均超过60%，革兰阴性菌耐药性见表3。

表2 不同类型标本革兰阴性菌分布 株数(%)

表3 革兰阴性菌对抗菌药物的耐药性 株数(%)

2.3 CRKP构成比及碳青霉烯酶耐药基因检测CRKP构成比从2014年的13.33%(4/30)升高至2015年的47.72%(21/44)，2016年达到高峰的50.00%(36/72)，差异有统计学意义(P=0.002，χ2=12.620)。采取有效感染控制措施后，2017年下降至35.19%(19/54)。呼吸道标本共检出肺炎克雷伯菌126株，其中CRKP 67株，比例高达53.17%，而血液标本CRKP比例最低，为5.88%(2/34)，尿液、无菌体液等其他标本中CRKP为27.50%(11/40)。不同标本类型CRKP差异有统计学意义(P<0.001，χ2=28.207)。PCR方法检测80株CRKP的耐药基因blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaVIM和blaOXA-48，67株携带blaKPC，6株携带blaNDM，2株携带blaIMP，其中1株细菌同时携带blaKPC和blaNDM。在所有耐药菌株中未检测到blaOXA-48和blaVIM。其碳青霉烯酶的分布见表4。

表4 CRKP中不同碳青霉烯酶的分布 例(%)

注：①一株肺炎克雷伯菌含有两种耐药基因。

3 讨论

研究表明，EICU感染最常见的病原菌是革兰阴性杆菌[1]。本研究共分离出病原菌1 240株，其中66.77%为革兰阴性杆菌。标本来源以呼吸道为主，占61.11%。其次依次为血液、尿液和无菌体液。这种分布主要是由EICU感染疾病谱分布决定的，呼吸系统是EICU患者感染的常见部位。

非发酵菌鲍曼不动杆菌分离率位居首位，呼吸道标本是其主要来源，是EICU肺部感染的优势条件致病菌。本研究中鲍曼不动杆菌耐药形势严峻，其对β内酰胺类、喹诺酮类、碳青霉烯类、氨基糖苷类药物普遍耐药，仅对替加环素、多黏菌素B敏感率较高，给临床治疗带来了很大困难。这与鲍曼不动杆菌有多种耐药机制，如产碳青霉烯酶、超广谱β内酰胺酶、16S rRNA甲基化酶，外膜蛋白通透性降低，外排泵过度表达有关[2-3]。

肠杆菌科细菌肺炎克雷伯菌分离率仅次于鲍曼不动杆菌。值得注意的是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌占40%，远高于同期全国平均水平[4-5]。2014年CRKP仅为13.33%，2015年和2016年出现爆发式增长，CRKP分别达到47.72%和50.00%。河南省部分地区是CRKP的高发地区，患者入住ICU、感染前使用碳青霉烯类抗生素、CRKP可通过质粒传播等均是CRKP高发的原因[6-7]。本研究显示，不同标本类型CRKP差异有统计学意义。呼吸道标本中CRKP最高(53.17%)，而血液标本中最低(5.88%)，尿液等其他标本中CRKP为27.50%。因此，临床可根据感染部位选择是否使用碳青霉烯类药物。本地区CRKP以耐药菌株克隆传播为主。2017年CRKP数有所下降。临床在治疗肺炎克雷伯菌感染时谨慎选择碳青霉烯类药物可能是减少CRKP的重要措施之一。

本研究中，CRKP碳青霉烯酶耐药基因以blaKPC为主，blaIMP及blaNDM少见。产KPC-2型碳青霉烯酶是河南地区肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制，这与大多数研究结果相符[8]。blaKPC基因通常位于质粒上，可以在不同种的细菌间传递，耐药转移速度快，所致感染病死率高。替加环素及多黏菌素是治疗CRKP的有效药物。而有研究表明，替加环素、多黏菌素耐药的CRKP已经出现[9]。预防CRKP对其耐药成为临床感染治疗及院内感染控制工作的重点之一。

与肺炎克雷伯菌不同的是，本研究中大肠埃希菌尚未出现碳青霉烯类药物耐药。其对阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率均小于20%。血液标本是大肠埃希菌的首位来源，其次是痰液和尿液，这也与肺炎克雷伯菌主要来源于痰液不同。临床在经验性用药时需考虑感染部位的病原菌分布。

总之，EICU革兰阴性菌感染常见且耐药形势严峻，给临床治疗带来了巨大的挑战。根据质谱鉴定结果结合该细菌的药敏流行病学及耐药基因资料，经验性用药的精准度会更高。