HPLC法比较哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因的含量

鲍慧玮，徐阳，王永生，王诗涵

（1.长春中医药大学药学院，长春 130117；2.长春医学高等专科学校，长春 130031；3.吉林大学药学院，长春 130000；4.吉林农业大学，长春 130000）

中国林蛙（Rana temporaria chensinensis David）为蛙科动物的一种，主要分布在我国东北地区，其输卵管的干制品是东北道地药材—哈蟆油[1]。有关哈蟆油的研究越来越全面、深入[2]，其中药效成分之一的1-甲基海因在镇咳和抗炎等方面具有良好的药效作用[3-4]，是《中国药典》中哈蟆油鉴别的指标性成分[5-6]。哈蟆卵同样是中国林蛙的一部分重要产物，其产量与哈蟆油相近，但是往往被忽视。哈蟆卵现有的药理研究发现，哈蟆卵具有抑制血小板聚集、降低血脂、抗自由基、抗氧化、减少体内过氧化脂质的生成等作用，同样具有临床应用意义。本试验建立HPLC法测定1-甲基海因含量的方法，并比较其在哈蟆油和哈蟆卵中的含量，为哈蟆卵的进一步发展提供理论依据，促进林蛙产业的发展。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-10A型高效液相色谱仪、UV检测器、N-2000工作站（日本岛津公司）；KQ-250型超声波处理器（昆山市超声仪器有限公司）；CPA-225D型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 材料

哈蟆油样品、哈蟆卵样品由长春中医药大学姜大成教授鉴定为蛙科动物中国林蛙（R.temporaria chensinensis David）的输卵管和卵的干制品；1-甲基海因对照品（吉林大学药学院天然药化实验室自制，纯度＞99%）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；水（杭州娃哈哈集团有限公司）；二氯甲烷（分析级，北京化工厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Venusil MP-C1（8 4.6 mm 150 mm，5m）；流动相：水（100%）；检测波长：215nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：5L；理论塔板数：＞3 000；分离度：＞1.5，符合《中国药典》2015年版规定。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 取1-甲基海因对照品1mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度。精密量取0.2mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得0.019 4 mg/mL的1-甲基海因对照品。

2.2.2 供试品溶液的配制 哈蟆油供试品溶液的配制：称取哈蟆油供试品5.0g，置于锥形瓶中，加入二氯甲烷100 mL，超声10 min，过滤。将滤渣倒回锥形瓶内，再加入二氯甲烷100mL，超声10min，过滤。将滤液旋干，加甲醇溶解，转移置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

哈蟆卵供试品溶液的配制：称取哈蟆卵供试品5.0g，置于锥形瓶中，加入二氯甲烷100mL，超声10min，过滤。将滤渣倒回锥形瓶内，再加入二氯甲烷100 mL，超声10 min，过滤。将滤液旋干，加甲醇溶解，转移置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2.3 系统适应性试验

图1表明，供试品溶液均得到较好的分离，其色谱峰保留时间与对照品一致，阴性样品溶液中未见此种成分的色谱峰。

图1 1-甲基海因高效液相色谱图Fig.1 1-Methyl hydantoin high performance liquid chromatography

2.4 方法学试验

2.4.1 线性关系试验 精密称取17.555 mg 1-甲基海因对照品，置50mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，定容至刻度，即为35.11g/mL的1-甲基海因线性母液。分别精密吸取 1.0、0.5、0.3、0.2、0.1 mL 线性母液，置10mL容量瓶中，即得浓度分别为3.511、1.756、1.053、0.702、0.351g/mL的线性溶液。依次将线性溶液和母液注入高效液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱峰面积。以对照品浓度（X）为横坐标、色谱峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程为Y=2 271.8X+268.09（r=0.999 9），表明1-甲基海因在 35.110 0～0.351 1g/mL峰面积与浓度呈良好线性关系。

2.4.2 精密度试验 精密吸取1-甲基海因对照品溶液、哈蟆油供试品溶液、哈蟆油卵供试品溶液各10L，注入高效液相色谱仪中，连续分析6次，计算峰面积的RSD值分别为0.31%、1.82%、1.10%，表明在此试验条件下精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取哈蟆油和哈蟆卵供试品溶液，分别在室温放置0、2、4、6、8、12、24h，依法进行含量测定。结果RSD值分别为0.98%和1.22%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批供试品各6份，按照“2.2.2”项下方法制备哈蟆油和哈蟆卵供试品溶液，依法进行含量测定。结果RSD值分别为1.08%和1.63%，表明含量测定方法重复性良好。

表1 哈蟆油和哈蟆卵回收率结果Table 1 Results of recovery rate in oviductus ranae and wood frogs spawn

2.5 哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因含量的测定

分别取不同批次哈蟆油样品粉末和哈蟆卵样品粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依次注入高效液相色谱仪，进行含量测定，外标法计算1-甲基海因含量。结果（表2），哈蟆卵中1-甲基海因含量较哈蟆油高。

表2 哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因含量Table 2 Contents of 1-methyl hydantoin in oviductus ranae and wood frogs spawn （g/g）

3 讨论

本试验采用高效液相色谱法测定哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因的含量。虽然《中国药典》2015年版中明确了哈蟆油的鉴别方法就是以1-甲基海因作为标志物采用HPLC法进行鉴别，但是同为中国林蛙副产物的哈蟆卵中1-甲基海因的含量却并没有报道过[7-8]。

哈蟆卵具有抗焦虑、抗惊厥、抗疲劳、降血脂、抗氧化等药理作用[9-15]，这一发现可以改变哈蟆卵作为废弃物的现状，随之的质量评价方法就极为重要。本试验首次测定了哈蟆卵中1-甲基海因的含量，并与哈蟆油进行比较发现，哈蟆卵中同样含有1-甲基海因，且含量较哈蟆油高，这不仅为哈蟆卵的质量评价提供了方法，还为其今后的研究指明了方向。