高稳定二溴海因水溶液制备及其消毒效果研究

2019-01-30周龙梅张亮亮王金燕

日用化学工业 2019年1期

周龙梅，张亮亮，王金燕

（1.山东利尔康医疗科技股份有限公司上海研发中心，上海 201203；2.山东利尔康医疗科技股份有限公司，山东德州 253032）

二溴海因是一种新型释放性消毒剂，可应用于家庭清洁消毒，具有广谱高效、无毒低味、安全环保等特点[1-4]。文献[5， 6]表明二溴海因中的有效溴是杀灭微生物的主要成分，其在水溶液中能与水反应生成强氧化性的次溴酸和游离溴，将微生物体内的生物酶氧化分解而失效，从而达到杀灭微生物的效果，是比较理想的家用杀菌剂。

由于二溴海因20 ℃在水中溶解度低（0.1 g/100 mL）、溶解速度慢、溶解后稳定性差且只能以固体形态存储使用等缺陷导致其应用受到限制。徐丽君等[7]研究表明二溴海因在含氮和含氧的溶剂如尿素、乙醇、二甲基乙酰胺、乙腈等中有较好的溶解度，但除了乙腈外，二溴海因在其他溶剂中不稳定，而乙腈具有一定的毒性。刘腊芹等[8]制备了二溴海因/二氧化硅复合粒子，该复合粒子有助于二溴海因在水中分散，从而提高二溴海因的杀菌效果，不过该产品仍是一款固体产品。笔者采用稳定剂氨基磺酸及助溶剂三聚磷酸钠、酸碱调节剂磷酸三钠与纯化水、二溴海因制成水溶液，研究其水溶液的稳定性和杀菌性，为其推广应用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（ATCC 8099）、铜绿假单胞菌（ATCC 15442）、白色念珠菌（ATCC 10231），中国普通微生物菌种保藏中心提供。

胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）及胰蛋白胨生理盐水（TPS）稀释液，青岛海博生物技术有限公司。

有机干扰物：质量分数3%牛血清白蛋白（BSA），河南一褀生物技术有限公司；中和剂：D/E中和肉汤，美国BD公司；标准硬水，硬度342 mg/L。

二溴海因（化学名：1，3-二溴-5，5-二甲基乙内酰脲，1，3-二溴-5，5-二甲基海因，英文缩写DBDMH，质量分数≥98%），河北鑫陶源环保科技有限公司；氨基磺酸（AR，质量分数≥99.5%）、三聚磷酸钠（CP）、磷酸三钠（无水CP，质量分数≥98.0%），国药集团化学试剂有限公司；实验用水为纯化水。

UV1801型紫外/可见分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 二溴海因水溶液制备

将氨基磺酸、三聚磷酸钠、磷酸三钠及二溴海因按质量比5∶10∶3∶2.5称量，将氨基磺酸、三聚磷酸钠、磷酸三钠加入纯化水中搅拌溶解，再将二溴海因加入上述混合溶液，搅拌溶解制备质量浓度为25.3 g/L的浅黄色透明二溴海因溶液。

1.2.2 二溴海因含量测定

二溴海因含量测定参考国标GB/T 23849-2009。精密量取二溴海因水溶液样品5 mL，置于加有125 mL纯化水、2 g碘化钾的250 mL碘量瓶中，电磁搅拌器上充分搅拌，使样品完全溶解。加2 mol /L硫酸溶液20 mL，用20 mL蒸馏水冲洗瓶口及瓶壁，迅速加盖水封，置暗处5 min，然后用硫代硫酸钠标准液滴定，至溶液变淡黄色，加淀粉指示剂继续滴定至蓝色消失，记录耗用的硫代硫酸钠标准溶液的体积（同时作空白）。计算公式为：

式中，ρ为二溴海因质量浓度，g/L；V1为消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，mL；V2为空白滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mL；V为量取样品的体积，mL；c为硫代硫酸钠标准溶液摩尔浓度，mol/L。

1.2.3 稳定性测定

将包装完好的二溴海因水溶液置于37 ℃恒温箱内放置90天，于放置前、后分别测定二溴海因含量。

1.2.4 悬液定量杀菌实验

悬液定量杀菌实验参考2002年版《消毒技术规范》。

菌悬液制备：刚培养完的斜面，用3～4 mL TPS洗菌，根据实际菌落数用TPS进行适当稀释，体积比1∶1的菌液与BSA混合成菌悬液。悬液法回收菌落数1×107～5×107CFU /mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌及1×106～5×106CFU /mL白色念珠菌。

实验组：取1 mL菌悬液加入4 mL消毒液中计时，计时结束后，取0.5 mL加入4.5 mL D/E中和肉汤中，剧烈振荡，中和10 min。适当稀释进行接种，37 ℃培养48 h。

阳性对照组：取0.5 mL菌悬液加入4.5 mL TPS中，用TPS进行10倍稀释，选择适当稀释梯度进行接种，37 ℃培养48 h。

计算各组活菌浓度（CFU/mL）及杀灭对数值。

1.2.5 现场消毒实验

现场消毒实验参考2002年版《消毒技术规范》。

消毒前，将2只无菌棉拭子于含5 mL的TPS试管中沾湿，对5 cm×5 cm区块涂抹采样，横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭子采样端剪入原TPS试管内，振荡20 s或振打80次，适当稀释后作为阳性对照组样本。每个样本接种2个平皿，放37 ℃恒温箱中培养48 h。

将25.3 g/L的二溴海因水溶液用标准硬水稀释成二溴海因质量浓度为1 000 mg/L的消毒液进行实验。

用消毒液擦于物体表面进行消毒，消毒后将2只无菌棉拭子于含5 mL D/E中和肉汤试管中沾湿，对消毒区块涂抹采样，横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭子采样端剪入原采样液试管内，电动混匀器振荡20 s或振打80次，作为消毒组样本。每个样本接种2个平皿，放37 ℃恒温箱中培养48 h。

对消毒前后采样标本进行活菌计数，计算杀灭对数值。

2 结果与讨论

2.1 二溴海因水溶液紫外吸收光谱

涂文利等[9]研究发现硫酸铵、氨基磺酸对次氯酸钠溶液有稳定作用，用紫外分光光度计对含有硫酸铵、氨基磺酸的次氯酸钠溶液扫描，发现在波长245 nm处有吸收峰，表明有氯胺活性物生成。次氯酸钠溶液中的有效氯与氮原子形成新的共价键，从而稳定溶液中的次氯酸钠。笔者研究发现氨基磺酸对水溶液中的二溴海因也有稳定作用，而硫酸铵不具有稳定作用。取1.2.1制备的二溴海因水溶液1 g加入到99 g纯化水中进行稀释，稀释液进行紫外吸收光谱测定（图1a）；按照制备二溴海因水溶液添加比例，将氨基磺酸、三聚磷酸钠、磷酸三钠用纯化水溶解，取溶液1 g加入到99 g纯化水中进行稀释，稀释液进行紫外吸收光谱测定（图1b）；取0.025 g二溴海因加入到499.975 g纯化水中溶解进行紫外吸收光谱测定（图1c），以上3种溶液均以实验用纯化水作参比。由图1可知，a曲线在280 nm处有吸收峰，而b曲线和c曲线在此处都没有吸收峰。这说明二溴海因中的部分活性溴与氨基磺酸中的氮形成稳定共价键，因此减缓了二溴海因中活性溴的释放，使得二溴海因在水溶液中的稳定性加强。

2.2 二溴海因水溶液稳定性

由稳定性实验可知，存放前的二溴海因溶液质量浓度为25.3 g/L，37 ℃恒温箱放置90天后二溴海因溶液质量浓度为23.7 g/L，二溴海因含量的下降率仅为6.3%。

图1 紫外吸收光谱图Fig.1 UV absorption spectra

2.3 二溴海因的杀菌效果

将质量浓度25.3 g/L的二溴海因水溶液用标准硬水稀释成含二溴海因质量浓度分别为625，1 250及3 125 mg/L的消毒液进行杀菌实验；将37 ℃恒温箱内放置90天后质量浓度为23.7 g/L的二溴海因水溶液用标准硬水稀释成二溴海因质量浓度为1 250及3 125 mg/L的消毒液进行杀菌实验，测试结果见表1，表中二溴海因质量浓度为稀释后的实际使用浓度。

表1 二溴海因消毒效果Tab.1 Disinfection effect of DBDMH

第1组和第2组实验是新鲜配制的不同浓度的消毒液杀菌实验，质量分数 3%的牛血清白蛋白为干扰物。由表1结果可知，含二溴海因质量浓度为1 000 mg/L的消毒液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌悬液作用10 min，对其杀灭对数值均大于5.0；含二溴海因质量浓度为2 500 mg/L的消毒液对白色念珠菌作用10 min，对其杀灭对数值大于4.0；含二溴海因500 mg/L的消毒液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液作用10 min，对其杀灭对数值都大于5.0，而对铜绿假单胞菌菌悬液的杀灭对数值小于5.0，达不到2002年版《消毒技术规范》的要求；含二溴海因1 000 mg/L的消毒液对白色念珠菌作用10 min，对其杀灭对数值小于4.0，达不到2002年版《消毒技术规范》的要求。

第3组实验为37 ℃恒温箱内放置90天后的消毒液杀菌实验，质量分数 3%的牛血清白蛋白为干扰物。结果表明，消毒液经过老化后对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌悬液作用10 min，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌的杀灭对数值都大于5.0，对白色念珠菌的杀灭对数值大于4.0。相对于新鲜配制的消毒液，其杀菌效果有所下降，但能达到2002年版《消毒技术规范》的要求。

二溴海因液体消毒产品，相对于粉剂或片剂二溴海因消毒产品溶于水形成消毒剂来说，其水溶液中二溴海因中部分活性溴与氨基磺酸分子中的氮原子形成稳定共价键，减缓了二溴海因中活性溴的释放，导致水溶液中活性溴浓度较低，杀菌效果差。提高其浓度，增加活性溴释放，其杀菌效果才能达到2002年版《消毒技术规范》的要求。