心肌梗死大鼠钙敏感受体表达与心肌细胞凋亡的变化

袁 辉， 扬国宏， 李 姝， 李 丽， 宋高臣， 徐长庆， 孙 健△

( 1. 牡丹江医学院， 黑龙江 牡丹江 157011； 2. 哈尔滨医科大学病理生理教研室， 黑龙江 哈尔滨 150081)

钙敏感受体(calcium sensing receptor，CaSR)是G蛋白耦联受体(G protein-coupled receptor, GPCR) C家族成员。近年来研究证实, CaSR 在心血管系统有功能性表达, 并且参与一些重要病理过程的发生发展, 例如:心肌缺血/再灌注损伤[1]和心肌肥大等[2]。本课题组曾先后观察了不同鼠龄正常大鼠、离体灌流和冠脉结扎复制的大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中的心肌 CaSR 的表达规律[1,3,4]，然而CaSR在大鼠心肌梗死不同时期的表达规律，及其对心肌细胞凋亡的影响尚不清楚。因此，本实验拟观察急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后不同时间内CaSR的表达情况，并揭示其对心肌细胞凋亡和相关凋亡蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

超声系统(IE33，荷兰)，H - 600 型透射电镜 (日立)，荧光定量PCR仪(Exicycler 96，韩国)，紫外分光光度计(NANO 2000，America)，BL420F生物机能实验系统(成都泰盟)，肌酸激酶(CK)和LDH测定试剂盒(南京建成)，高纯总RNA快速提取试剂盒(BioTeke)，大鼠心肌肌钙蛋白cTnT ELISA试剂盒(USCN)，TUNEL凋亡检测试剂盒(Germany)，Bax、Bcl-2多克隆抗体 (Santa Cruz, CA, USA)，CaSR、caspase-3、caspase-9单克隆抗体(Abcam，英国)。

1.2 急性心肌梗死模型制备

选取健康Wistar大鼠(8周龄)，随机分为对照即假手术组(Sham组，冠脉只穿线不结扎)和AMI模型1周、2周和4周组(每组成功存活n=5)，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉，AMI组大鼠左前胸去毛消毒，开胸暴露心脏，剪开心包，在左心耳下缘与肺动脉间可见左冠状动脉前降支起始部，在距离主动脉根部约3～5 mm处，以左冠状静脉为标志，用尼龙缝线结扎造成缺血，建立AMI模型。

1.3 心血流动力学检测

分别于实验后第1、2、4 周采用10%水合氯醛实施麻醉，然后将Millar导管沿颈动脉插入至左心室, 测定左心室舒张末期压(left ventricular end diastolic pressure, LVEDP)，左心室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)，左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和最大下降速率(-dp/dtmax)等血流动力学指标。

1.4 透射电镜观察心肌超微结构

大鼠经耳缘静脉推注10%KCl处死。取各组大鼠心尖区心肌组织，切成约1 mm3的组织块，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，丙酮逐级脱水，石蜡包埋，超薄切片，1%醋酸双氧铀及枸橼酸铅双重染色，H-600A型透射电镜观察。

1.5 Real-Time PCR检测CaSR mRNA表达

取梗死区心肌组织低温充分研磨后，利用TRIzoI提取试剂盒提取各样本总RNA后，进行RNA浓度和纯度检测，接着逆转录合成cDNA。大鼠引物序列(表1)。

Tab. 1 Sequences for primers

Real-Time PCR反应体系20 μl(cDNA 1 μl，上下游引物各0.5 μl，SYBR GREEN mastermix 10 μl，ddH2O 8 μl)。采用相对定量 2- △△ CT法分析数据。

1.6 Western blot检测心肌组织中CaSR、Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9 蛋白表达

提取梗死区心肌组织蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。SDS- PAGE凝胶电泳，转膜，孵育Ⅰ抗anti-CaSR(1∶500)，anti-Bcl-2(1∶ 1 000)、anti-Bax(1∶1 000)、anti-caspase-3(1∶ 1 000)和anti-caspase-9(1∶500)，4℃过夜。洗膜后加入羊抗兔IgG-HRP II 抗(1∶5 000)，ECL发光法测定目的条带，凝胶图像处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。

1.7 TUNEL染色观察细胞凋亡

TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labelling)染色方法检测心肌细胞凋亡。按试剂盒说明书操作，切片常规脱蜡脱水，过氧化氢封闭，内源性过氧化物酶标记，信号转化和分析。光镜下观察细胞凋亡情况。凋亡的细胞核呈现棕褐色或黑色；正常的细胞核用苏木素复染成蓝色，每张切片随机取 5个高倍视野, 计数细胞总数及凋亡细胞数, 计算凋亡率。凋亡率=(凋亡细胞/全部细胞)×100%。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 AMI 模型组的心电图的变化

结扎左冠状动脉前降支后，左室前壁心肌组织搏动减弱，颜色苍白，此时心电图可见R波振幅升高，ST 段弓背向上抬高(图1)，表明AMI 模型建立成功[5]。

Fig.1Changes of surface electrocardiogram in rats before and after left anterior descending coronary artery ligation

A: The Sham group; b: The AMI group

2.2 AMI 模型组大鼠心肌超微结构变化

大鼠心肌超微结构变化如图2 所示。电镜下可见，AMI组细胞核和线粒体都发生了严重损伤，表现线粒体肿胀，心肌肌节断裂、排列紊乱，肌原纤维溶解；上述结果说明心肌梗死后大鼠心肌细胞发生凋亡，电镜下可见凋亡特征性的形态学改变：细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞核内出现许多空泡结构，细胞核裂解为碎块。

Fig.2Ultrastructural changes of myocardial tissue under electron microscope (×15 000)

2.3 AMI 模型组大鼠心血流动力学变化

和Sham 组相比，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均有减少，LVEDP升高(P<0.05或0.01，表2)；但不同时间内基本没有变化。

GroupLVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(×103mmHg/s)-dp/dtmax(×103mmHg/s)Sham118.2±12.05.8±1.05.1±0.64.1±0.6AMI(1W)87.4±7.5*13.2±1.4**3.0±0.8*2.1±0.3*AMI(2W)86.2±8.7*13.3±1.8**3.3±0.5*2.3±0.4*AMI(4W)87.4±7.5*13.2±1.4**3.0±0.8*2.1±0.3*

LVSP： Left venteicular systolic pressure； LVEDP： Left ventricular end diastolic pressure； +dp/dtmax： Maximum increase rate of left chamber pressure； -dp/dtmax： Maximum falling rate of left chamber pressure

*P<0.05,**P<0.01vssham group

2.4 AMI 模型组大鼠血清CK和LDH活力及cTnT水平的变化

和Sham组相比，AMI组cTnT 水平、CK和LDH活性均升高 (P<0.05或0.01，表3)，随着心肌梗死的发展，cTnT 水平和CK活性逐渐降低，LDH变化不明显。

GroupcTnT(pg/ml)CK(U/ml)LDH(U/ml)Sham113.1±5.42.4±0.91.3±0.0AMI(1W)434.5±41.8**5.7±1.1**2.3±0.2**AMI(2W)319.4±7.6**##5.5±1.5**1.9±0.1**##AMI(4W)239.8±8.0**##△△4.9±0.7**2.0±0.2**#

CTnT： Troponin T； CK： Creatine kinase； LDH： Lactic dehydrogenase

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsAMI-1W;△△P<0.01vsAMI-2W

2.5 AMI 模型组大鼠心肌组织细胞凋亡的变化

TUNEL检测结果显示(图3)，造模后1、2、4周Sham组心肌细胞凋亡很少(3.55%±1.20%)、 (5.17%±1.94%)、(4.62%±1.73%)；心梗后不同时间心肌细胞凋亡明显增加分别为：(26.48%± 5.22%)、(34.82%±6.88%)、 (41.59%± 7.43%)，差异有显著性(P<0.01)。

Fig.3Results of TUNEL staining in rat cardiomyocytes and statistical analysis of apoptosis indexes (×400)

**P<0.01vssham group;#P<0.05vsAMI-1W

2.6 AMI 模型组大鼠心肌组织CaSR mRNA和CaSR蛋白表达的变化

如图4示：与Sham组相比, 随着时间延长，AMI组大鼠心肌组织CaSR mRNA和CaSR 蛋白表达均明显增加，第1、2、4周相比差异显著(P< 0.05)。

2.7 AMI 模型组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表达的变化

Western blot检测术后不同时间大鼠各组心肌组织Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白的表达(图5)：术后第1、2和4周时和Sham组相比，AMI组Bcl-2蛋白表达均减少(P<0.01)，而促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-9的表达随着时间的延长逐渐增多，caspase-9在第4周时有所下降，但和第1、2周相比无统计学意义(P>0.05)。

Fig.4The changes of CaSR protein and mRNA by Western blot and quantitative real-time PCR after AMI from 1 week to 4 weeks

A: The changes of CaSR mRNA by quantitative real-time PCR; B: The changes of CaSR protein by Western blot; C: Quantitative analysis of the Western blot result

**P<0.01vssham group；##P<0.01vsAMI-1W；△△P<0.01vsAMI- 2W

Fig.5The expressions of Bcl- 2, Bax, cleved caspase-3 and cleved caspase-9 protein in rat cardiac tissue from different time

Bcl- 2: B Cell Leukemia 2； Bax: Bcl-2 associated X protein

*P<0.01vssham group;##P<0.01vsAMI-1W;△P< 0.05vsAMI-1W

3 讨论

钙敏感受体(CaSR)是调节钙代谢的重要因素，还参与细胞增殖、分化等的调节。自2003年Wang等[3]首次证实在大鼠心肌组织存在CaSR表达后，本课题组曾先后证实CaSR参与了一些重要病理过程的发生发展，如2015年白淑芝等[6]研究发现大鼠糖尿病性心肌病进展过程中 CaSR 的表达逐渐降低，并可能导致钙稳态紊乱参与糖尿病心肌病的发生；2012年Guo J等[7]研究发现动脉粥样硬化大鼠心肌 CaSR 的表达增加导致对心肌梗死的敏感性增加。但 CaSR 在心肌梗死后不同时期的表达变化规律还不清楚。本研究旨在观察CaSR在心肌梗死后不同时期的表达变化规律，及其对心肌细胞凋亡的影响。

临床实践表明，心肌损伤过程中，常伴有心电图和血清酶谱的变化，其中 ST 段抬高是心肌缺血的典型表现；而血清心肌酶水平是心肌细胞受损程度的重要标志，包括血清 LDH、CK、CK-MB 等；其中尤以肌钙蛋白特别是 cTnT 表达水平敏感性和特异性最高，是目前理想的心肌梗死标志物[8]。

本研究显示，AMI组心电图呈缺血样改变，S-T 段明显上抬，此时大鼠左室前壁心肌组织搏动减弱，颜色苍白，出现心肌梗死变化。且模型成功后不同时间均伴有血清酶谱 LDH、CK 和肌钙蛋白c TnT 表达水平的升高，心功能各指标LVSP、-dp/dtmax、+dp/dtmax的减少和LVEDP的增加。这些均表明本实验成功复制了大鼠心肌梗死模型。

为了观察心肌梗死后 CaSR 在不同时间内的表达变化，实验中分别采用RT-PCR和Western blot技术, 观察了CaSR mRNA和蛋白在AMI模型成功后第1、2、4周的表达情况。结果发现：随着心肌梗死的发展，大鼠心肌组织中CaSR mRNA和蛋白表达均逐渐增多，提示心肌 CaSR的表达增加参与了心肌梗死的发生发展。

电镜下细胞超微结构的观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法，本实验电镜观察结果显示，AMI组大鼠心肌细胞中细胞核和线粒体都发生了严重损伤，表现为心肌肌节纤维排列紊乱，肌丝溶解、断裂；线粒体肿胀；染色质浓缩、沿核膜呈周边性排列，形成大小和形状不一的碎片及块状；本实验还应用TUNEL法检测了不同时间各组大鼠心肌细胞凋亡情况，并计算凋亡指数。结果显示，与Sham 组相比，随着时间的延长，AMI组大鼠的心肌细胞凋亡指数显著增高，上述结果说明心肌梗死后心肌损伤可以引起大鼠心肌细胞凋亡，发生凋亡特征性的形态学改变。

研究证实，细胞凋亡是心肌缺血损伤中心肌细胞死亡的重要方式之一[9]。Caspase 家族是执行细胞凋亡作用的一组半胱氨酸蛋白酶，其成员 Caspase-3 是整个凋亡级联反应中的标志酶。Caspase-3 通过对蛋白激酶、核酸酶及细胞骨架的裂解，直接使细胞发生凋亡，被认为是执行死亡蛋白酶[10]；细胞凋亡有两条经典途径，其一是细胞外的死亡受体途径，其中涉及多种凋亡调控基因如促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2等，最终作用于Caspase3，使其活化后促发下游基因的活化，最终导致细胞凋亡的发生[11,12]。经过实验，我们发现，各时间点AMI组抑制凋亡的相关蛋白Bcl-2表达减少，而与促进凋亡的相关蛋白表达Bax，caspase-3和caspase-9则增多；且有明显时间差异。有研究证实[7]活化CaSR 的信号，通过一系列的G 蛋白，能调节细胞内钙和MAPK信号途径进而激活诱导细胞凋亡。本研究结果显示在心肌梗死发生发展过程中，心肌组织中CaSR表达逐渐增多，但是是否也通过MAPK信号传导途径调控细胞凋亡相关蛋白如Bax，caspase-3的表达，从而调控心肌细胞凋亡的发生，我们将在进一步研究中探讨。

总之，我们的结果表明随着大鼠急性心肌梗死时间的延长，心肌组织中CaSR表达逐渐增多，通过某些信号传导途径调节凋亡相关蛋白的表达，从而调控了细胞凋亡的发生，参与心肌梗死的发生发展过程。但其具体机制还需我们在今后的研究中进一步探讨。