二甲双胍对慢性应激大鼠抑郁行为的影响*

李改芬， 赵 名， 赵 彤， 成 祥， 范 明△， 朱玲玲△

(1. 首都医科大学脑重大疾病研究中心， 北京脑重大疾病研究院， 北京 100069； 2. 军事医学研究院军事认知与脑科学研究所， 北京 100850)

抑郁症是一种比较常见的情感障碍性疾病，近年来其发病率越来越高，严重影响患者的身心健康，观察发现导致抑郁症患者发病的原因大多是由于各种各样的压力刺激所致，包括外在环境压力和内在精神压力[1]。虽然在当前抑郁症的确切发病机制还未查明，但经前期大量研究发现，抑郁症被认为是一种神经系统疾病，抑郁症的发生发展与海马的病理变化呈正相关[2]。众所周知，糖尿病是一种常见的慢性疾病，在疾病的长期折磨下，糖尿病患者并发抑郁症的人数明显高于正常人[3]。临床调研发现，糖尿病合并抑郁症的患者经过抗糖尿病治疗后，不仅血糖得到有效控制，抑郁症状也有所减轻[4]。二甲双胍是目前治疗2型糖尿病的临床一线药物，其药理作用不仅包括降低血糖，还有抗衰老和神经保护的作用[5]；并且二甲双胍联合抗坏血酸能够减轻糖尿病和抑郁症共患病患者的抑郁症状[6]，因此，本研究在慢性不可预测性温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS) 大鼠抑郁模型上探讨二甲双胍的抗抑郁作用及其初步的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

SPF级的SD大鼠40只，8周龄，体重(280～300)g，雄性，由北京维通利华实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(京)2016-0006，质量合格证号：11400700259457。 实验前适应性饲养3 d，室温(23±2)℃，湿度50%～70 %，光照与黑暗交替为12 h /12 h，可自由饮水摄食。

二甲双胍(S1741)，由碧云天生物技术有限公司提供。二甲双胍用生理盐水溶解，新鲜配制，每天腹腔注射100 mg/kg，处理时间为14 d[7-9]。

1.2 CUMS抑郁模型的建立

按照文献方法[2，10]进行抑郁大鼠模型的复制。刺激包括鼠笼倾斜45° 24 h，束缚应激2 h，潮湿垫料24 h，禁食24 h，禁水24 h，夹尾1 min，4℃冰水游泳5 min，45℃热刺激5 min，噪音2 h，持续照明24 h，闪光灯照明24 h(光暗周期2 h / 2 h)。上述11种应激随机安排，每天1种刺激，相邻两天同一刺激不可连续出现，使大鼠不能预测应激。

1.3 动物分组及给药

将动物随机分为4组(n=10)：对照组(CON组)、二甲双胍组(MET组)、模型组(CUMS组)、模型+二甲双胍组(CUMS+MET组)；两个二甲双胍组在模型制备完成后每天腹腔注射二甲双胍(100 mg/kg)1 ml，对照组和模型组注射等体积的生理盐水，连续注射14 d。所有的实验动物管理及实验均遵守中华人民共和国卫生部动物实验管理条例和军事医学研究院实验动物管理条例。

1.4 实验方法

(1)体重测量：在实验开始前，测一次大鼠体重，各组大鼠体重无差异。实验开始后，每周测一次体重。(2)糖水偏好实验：训练期：每只大鼠禁水禁食23 h，然后给予一瓶1%糖水和一瓶纯水，每隔5 min交换一下水瓶的位置，持续1 h。测试期：每只大鼠禁水禁食23 h后给予提前称好的1%糖水和纯水，每隔5 min交换一下水瓶位置，持续1 h，最后记录两个水瓶消耗量并计算糖水偏爱率，糖水偏爱率=1%糖水饮用量/(1%糖水饮用量+纯水饮用量)。(3)强迫游泳实验：将大鼠放入盛有40 cm水的水池中，确保大鼠尾尖触碰不到水池底部，强迫大鼠游泳，水温为室温，每只大鼠单独测试，每次测试5 min，观察并记录大鼠累计游泳不动时间。静止不动：停止挣扎或呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面。(4)悬尾不动实验：将大鼠尾端3 cm部位固定在水平木棍上，使大鼠呈倒悬状态，头部距地面5 cm左右，每只大鼠单独测试，测试5 min，观察每只大鼠累计不动时间并计时。(5)旷场实验：应用ANY-maze动物行为分析系统检测大鼠的自主活动情况，每只大鼠提前适应5 min，然后将大鼠放入九宫格中，每次放1只，由计算机自动记录大鼠的活动情况，每次5 min。每只动物测试完毕将场地清理干净，并用酒精喷洒祛除异味。主要观察指标为总运行距离和在中央区域运行的距离。

1.5 实验动物取材

所有行为学测试完毕后进行动物取材，将动物用戊巴比妥(60 mg/kg, 腹腔注射)进行麻醉，断头并剥离脑组织将其放入预先准备好的组织固定液(4%多聚甲醛)中固定并保存。

1.6 尼氏染色

(1)将切好的石蜡切片放入烤箱，65℃过夜；(2)第2日将切片取出放入二甲苯中脱蜡，每次10 min，共3次；(3)将切片依次放入100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中脱水，各2 min，然后用蒸馏水冲洗3次，每次5 min；(4)将切片放入提前备好的1%甲苯胺蓝中进行染色，37℃孵育30 min，然后用蒸馏水冲洗3次，每次5 min；(5)95%乙醇分化至尼氏小体呈蓝色；(6)100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 二甲双胍对CUMS大鼠体重的影响

抑郁症的临床表现中包括食欲不振，因此我们每周测一次大鼠的体重，观察各组大鼠的体重增长变化。体重测量结果如表1显示：CON组与MET组相比，两组大鼠体重增长无明显变化，差异无统计学意义；CUMS组与CUMS+MET组相比，两组大鼠体重增长无明显变化，差异无统计学意义，提示二甲双胍腹腔注射不会影响大鼠的体重增长。但是与CON组相比，CUMS组大鼠体重增长明显较慢(P<0.01或P<0.05)，差异有统计学意义；经过二甲双胍处理后， CUMS大鼠的体重增长仍然明显较慢，再次提示二甲双胍腹腔注射不会影响大鼠的体重增长，并且说明CUMS可以导致大鼠体重增长减慢。

Tab. 1 Effects of metformin on the rats’ body weight (g, n=10)

CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group

2.2 二甲双胍对CUMS大鼠糖水偏爱的影响

糖水偏爱实验可以检测大鼠是否有快感缺乏，而快感缺乏是抑郁症的症状之一。实验结果如表2所示：3周CUMS应激后，CUMS组和CUMS+MET组大鼠的糖水偏爱率与CON组相比均明显降低(P<0.01或P<0.05)，差异有统计学意义，提示CUMS抑郁模型可以建立成功；5周CUMS应激后即二甲双胍注射2周后，与CON组相比， CUMS组大鼠的糖水偏爱率明显降低，而CUMS+MET组大鼠的糖水偏爱率有所上升(P<0.01或P<0.05)，差异有统计学意义，提示二甲双胍可以改善CUMS大鼠的糖水偏爱率。

GroupAfter 3 weeks of CUMSAfter 5 weeks of CUMSCON60.94±5.9463.36± 5.24MET60.68±5.0661.19± 6.22CUMS37.45±3.22**48.72±15.44*CUMS+MET37.62±3.40**59.31±17.14#

In this experiment, CUMS stress stimulation lasted for 5 weeks, metformin was injected intraperitoneally in the last 2 weeks. CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group;#P<0.05vsCUMS group

2.3 二甲双胍对CUMS大鼠的悬尾不动和强迫游泳不动的影响

悬尾不动实验和强迫游泳不动实验可以检测大鼠是否具有绝望无助行为表现，绝望无助是抑郁症的重要表型之一。实验结果如表3所示：与CON组相比， CUMS组大鼠的悬尾不动时间和强迫游泳不动时间均明显延长(P<0.01或P<0.05)，差异有统计学意义，提示CUMS组大鼠出现绝望无助行为。与CUMS组比较，二甲双胍注射两周后，CUMS+NET组大鼠的强迫游泳不动时间明显减少(P<0.01或P<0.05)，差异有统计学意义，但是大鼠的悬尾不动时间没有明显减少，差异无统计学意义，提示二甲双胍可以改善大鼠的强迫游泳不动。

GroupTSTFSTCON104.66±48.2104.50±2.953MET88.70±26.7084.80±2.043CUMS138.61±35.593*44.56±16.627**CUMS+MET104.85±37.63226.80±15.339#

TST: Tail suspension test; FST: Forced swimming test; CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group；#P<0.05vsCUMS group

2.4二甲双胍对CUMS大鼠自发活动的影响

自发活动可以说明大鼠的抑郁状态，自发活动减少说明大鼠处于抑郁状态中。实验结果如图1显示：与CON组相比， CUMS组大鼠在旷场中总运行距离减少、在中央区域运行距离减少、穿越中央区域的次数减少(P<0.05)，差异有统计学意义，提示CUMS组大鼠处于抑郁状态中，而经过二甲双胍处理后的CUMS+MET组的大鼠在旷场中总运行距离增加(P<0.05)，差异有统计学意义，在中央区域运行距离没有显著增多、穿越中央区域次数没有显著增多，差异无统计学意义，但是具有增多的趋势；综上结果，提示二甲双胍可以增加CUMS大鼠的自发活动,改善其抑郁状态。

CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and metformin group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group；#P<0.05vsCUMS group

2.5 二甲双胍对CUMS大鼠海马形态结构的影响

既往报道提示，慢性应激会导致海马的功能和形态发生异常改变，尤其是海马CA1区和CA3区对慢性应激刺激比较敏感。正常情况下，大鼠海马神经元结构完整、染色均一、细胞排列整齐。根据实验结果(图2)可得：CON组和MET组大鼠海马CA1和CA3区的细胞排列较为整齐，染色均一，细胞结构完整。而CUMS组与CON组相比，其大鼠海马CA1和CA3区细胞排列紊乱、个数减少、染色变浅、细胞之间的间隙增大；经过二甲双胍处理后的CUMS+MET组大鼠的海马CA1和CA3区的细胞排列紊乱、个数减少、染色较浅、细胞间隙增大的问题有所改善。上述海马形态结构变化提示二甲双胍可以修复CUMS导致的海马形态结构紊乱。

3 讨论

CUMS是国内外公认的动物抑郁症模型，因其能模拟抑郁症的环境诱因，诱导实验动物出现抑郁核心症状,所有被广泛应用于抑郁症的发病机制和抗抑郁新药研究[11]。大脑海马是应激反应的作用靶区，参与情绪反应和学习记忆，其损伤与抑郁症的发生发展密切相关[2]；而且糖尿病与抑郁症皆可损伤海马血脑屏障的完整性[12]。因此本实验采用二甲双胍对CUMS抑郁模型进行干预，观察其疗效及其可能的作用机制，并作尼氏染色观察各组大鼠海马形态变化。行为学结果显示CUMS抑郁模型大鼠体重增长显著减慢，糖水消耗量显著降低，悬尾不动和强迫游泳不动时间显著延长，自发活动明显减少，表明CUMS大鼠出现快感缺乏、绝望无助症状，处于抑郁状态，抑郁模型建立成功。经过二甲双胍处理，CUMS大鼠海马的CA1和CA3区的神经元得到明显恢复，抑郁行为得到明显改善；与既往报道一致，上述行为学的改变与大鼠海马的形态变化保持一致，表明二甲双胍发挥抗抑郁的效应可能与修复受损的海马有关。

Fig.2Effects of metformin on hippocampal morphology in CUMS rats(Nissl staining,n=3)

CON: Control group; MET: Metformin group; CUMS: Chronic unpredictable mild stress group; CUMS+MET: Chronic unpredictable mild stress and Metformin group; Hipp: Hippocampus. The districts of CA1 and CA3 are the part of the gray box shown in the top picture respectively, both of their magnification times are 40x

近年来糖尿病和抑郁症两病共患的发病率逐渐升高，在糖尿病并发抑郁症的患者中发现，经过抗糖尿病药物的治疗，患者的血糖和抑郁症状都得到了有效的控制，因此，越来越多的抗糖尿病药物被用于研究其是否具有抗抑郁的效应以及可能的作用机制。研究报道慢性应激刺激可导致大鼠的血糖含量水平升高，血糖升高导致炎症因子释放增多、氧化应激加强，从而加重抑郁症的症状；二甲双胍是一种常见的Ⅱ型抗糖尿病药，经过降低血糖、增加胰岛素含量，联合抗坏血酸减少氧化应激而发挥抗抑郁作用[6]。根据已有研究：50、75、100、150 mg/kg的二甲双胍连续腹腔注射21 d[7]，100 mg/kg的二甲双胍连续口服4周都能够改善CUMS诱导的大鼠抑郁行为[8]，加上我们实验室前期研究[9]，本实验选择采用100 mg/kg的剂量连续腹腔注射14d观察二甲双胍对CUMS诱导的抑郁行为的影响，结果显示，二甲双胍可以明显改善大鼠的快感缺乏、绝望无助和焦虑不安等抑郁行为。

抑郁症在当前被认为是神经系统疾病，随着深入研究发现，二甲双胍除了具有治疗糖尿病的效应外，对神经系统疾病也有一定的保护效应，例如：在阿尔茨海默病中，二甲双胍通过阻止PP2A与MID的结合，增加PP2A的生物活性，抑制MAPT磷酸化，减少NFTs形成；通过上调胰高血糖素生物活性，减低胰岛素抵抗，抑制神经元损害，激活神经干细胞，改善大脑神经损伤，改善阿尔茨海默病的认知障碍[13]。在MPTP诱导的帕金森小鼠模型中，二甲双胍可以抑制MPTP诱导的α突触核蛋白的磷酸化，上调蛋白磷酸酶2A的甲基化，抑制黑质纹状体路径中的星形胶质细胞的激活，增加黑质中脑源性神经营养因子的表达水平；二甲双胍还能激活AMPK，调节代谢能量分布，增加纹状体多巴胺含量，抑制小胶质细胞过度活化诱导的神经炎症，减轻MPP诱导的细胞毒性，减少神经元死亡，对MPTP诱导的帕金森小鼠发挥治疗作用[14]。二甲双胍被FDA认可是能够促进神经再生优化的药物，不仅可以促进神经干细胞的增殖，还能促进神经干细胞的分化，因此能够减少缺血性脑卒中的梗死区域并促进其恢复[15]。我们实验室前期研究也发现，二甲双胍对高原低氧诱导的认知损伤具有保护效应[9]，其作用机制可能与修复高原低氧诱导的海马形态结构紊乱有关。

综上所述，二甲双胍能够改善CUMS诱导的抑郁行为，其机制可能与修复受损的海马结构有关，其具体的作用机制有待进一步的深入研究。