功能性酿酒微生物的筛选及其在绿色酿造生产中的应用

李 娜，程 伟，张 杰，潘天全，彭 兵

（安徽金种子酒业股份有限公司，安徽阜阳236023）

酿酒微生物通过一系列的生化作用，形成各种代谢产物，使原酒中的主体香、辅助香等风味物质相辅相成。由于酿酒微生物种类多、区系丰富等原因，目前，对白酒产香微生物的研究还不够充分。应用现代分子生物学技术、微生物育种技术、微生物种群分析技术等，实现白酒酿造过程中功能性酿酒微生物的分离、培育与应用，进行种性分析、菌种改良等，揭示酿造微生物与白酒品评中“香、味、格”之间的联系，尤其是功能性酿酒微生物与白酒中呈香呈味物质的相关性研究等，将在白酒现代化进程中起到重要作用，是今后白酒风味化学研究的重要方向与趋势。根据功能性酿酒微生物的代谢特征及机制、产特征性风味物质微生物的代谢机理等，运用关键功能性酿酒微生物代谢及蛋白质代谢、糖代谢等代谢流，以期实现对关键功能性酿酒微生物及其特种功能性酶类的有效控制，具有重要的研究价值，进而起到调控白酒固态混合发酵体系代谢产物，丰富白酒中特征性风味物质，提升传统发酵生产水平等作用。在绿色发展的过程中，白酒企业应该注重构建科技含量高、资源消耗低、环境污染少的产业结构和生产方式，全面推行绿色酿造。

1 白酒酿造技术或应用方面的主要研究方向

目前，白酒酿造技术或应用方面的主要研究方向如下：（1）固态发酵调控的机理及其规律研究；（2）固态发酵白酒特征性风味组分判断方法及其与酿酒微生物的关联性分析评价；（3）固态发酵白酒呈香呈味化合物形成机理、感官品评科学化方法、白酒特征图谱分析等；（4）白酒酿造生产过程中多菌种微生物菌群的复杂性与风味化合物不稳定的关系；（5）大曲呈香、生香的未知性及制曲微生物毒素与酿造安全性评价等；（6）酿酒副产物的综合利用技术研究。但行业的研究基本上都在围绕白酒的口感风味这个主线，目的是满足不同消费者口味需求，具体涉及功能性酿酒微生物及其在白酒酿造生产工艺技术革新等方面的研究急需加强。

随着经济的发展与科技的腾飞，人们在满足物质层面的需求后开始追求健康、绿色、环保与可持续发展。20世纪80年代初，国家积极倡导创建绿色、园林式企业，白酒酿造企业也不例外。

生态酿酒被反复提起，并在厂区的建设、酿酒的工艺及副产物再利用方面得到长足的发展。具有代表性的是广西贵港国家生态工业示范园区。该园区由蔗糖田、制糖、酒精、造纸、热电联产、环境综合处理等6个系统组成。这6个系统相辅相成，通过副产物、废弃物和能量的相互交换和衔接，形成了较为完整的闭合工业生态网络[1]。

2007年9 月，中国酿酒工业协会牵头依托江南大学和行业9家骨干企业进行的“169”项目启动，是对行业的6项技术问题进行研究探索，取得了很大进展。但行业的研究基本上以围绕白酒的口感风味为主线，目的是满足不同消费者口味需求，具体涉及功能性酿酒微生物及其在白酒酿造生产工艺技术革新等方面的研究急需加强。绿色酿造启动流程再造，推动信息化，扎实推进“绿色酿造、智能制造”。

2 功能性酿酒微生物的筛选及其应用研究进展

2.1 窖泥微生物

窖泥在酿酒生产中随着窖龄的延长,营养成分的补充,酒醅发酵过程中温度的变化等因素,使窖池中微生物的生态分布相对稳定；特别是一些厌氧菌,如己酸菌、丁酸菌、甲烷菌等得到驯化，逐步改善原酒的香味及其协调性。传统老窖泥的形成，经过较长时间的泥糟相互浸润，功能微生物菌群的迁移、演变、生长代谢等过程，形成了窖池特定微生物区系，并逐渐实现老窖池的微生态平衡体系、微生物的富集驯化、物质积累等。借助白酒窖泥老熟老化机理研究构建的白酒窖泥功能菌种资源库及质量评估快检技术平台。运用现代生物工程技术繁育窖泥功能菌种并在窖泥改造中强化应用，将传统窖泥制备工艺与复合营养、复合功能菌配合技术相结合，精心制作而成的窖泥老熟微生态制剂，可以有效地增加窖泥生化活力，实现增己降乳和提高优质酒产率。通过免培养分子生物学技术和指针菌数理模型的利用，可以快速检测指针菌在窖泥中的存在状况，及时指导窖泥老熟微生态制剂的利用，达到窖泥质量的有效维护和管控。

安大金种子产业技术研究院课题组从金种子优质老窖泥分离获得的1株己酸菌（JZZ）作为生产菌种，菌株JZZ的菌落形态及其显微特征见图1。由图1可知，菌株JZZ为革兰氏阳性杆菌，顶端有芽孢，菌落呈白色圆形、扁平状，表面光滑，四周有较为明显的透明圈。经形态学和16SrDNA序列分析，窖泥己酸菌（JZZ）鉴定为克氏梭状杆菌[2]Clostridium kluyveri，是新的产己酸的菌株。

2.2 大曲微生物

大曲是以大麦、小麦等为原料，在人为控制的一定温度、湿度条件下，经过粉碎、加压等步骤形成砖块状的曲坯[3]。大曲的制作是在一个完全开放式的环境中进行，在制作过程中大曲会富集众多微生物，微生物的来源有空气、原料、水等。由于环境、原料等因素对大曲制作的影响，使得大曲中的微生物情况十分复杂，大曲中微生物种类主要有霉菌、细菌以及酵母菌。不同温度下，微生物种类各自的占比也不同，高温曲中富含大量的细菌，其次是霉菌，而酵母菌在高温下几乎没有。霉菌、细菌、酵母菌又被学者比喻为：霉菌——糖化动力，酵母菌——发酵动力，细菌——生香动力[4]。可见，这3种微生物在白酒酿造过程中具有十分重要的作用。金种子白酒酿造应用产蛋白酶嗜热细菌制备的细菌麸曲，具有一定的液化力、糖化力及蛋白质水解力等，有利于原料中淀粉的糖化和蛋白质的分解，强化了美拉德反应。

图1 金种子窖泥己酸菌菌株JZZ的菌落形态及其显微特征

图2 金种子大曲耐高温产蛋白酶嗜热细菌Nxzd4菌落形态及其显微特征

图3 金种子清香型酒醅产香酵母Jmx-01菌落及其显微(40×)特征

如图2所示，金种子大曲耐高温产蛋白酶嗜热细菌Nxzd4[5]的菌落呈乳白色，表面粗糙，大而扁平，边缘不整齐，呈放射状菌丝，透明性差，稍黏稠，易挑取；菌体多呈长杆状，单个较多，芽孢可见，有少数两连杆或三连杆链状现象，属芽孢杆菌。芽孢杆菌是酱香大曲中有益于酱香风味产生的功能微生物；从茅台酒高温大曲分离筛选得到的细菌中，选择有代表性的7株芽孢杆菌制成三角瓶纯种曲；纯种成品曲与生产用曲粉的香气比较接近，具有较强的酱香香气。

2.3 酒醅微生物

酒醅微生物主要来自于酒曲、窖泥、地面、工具及设备等生产现场的环境中，其分布、消长和代谢情况对白酒的产量、品质、风味起着至关重要的作用[6]。酒醅的不同发酵周期、不同层面的微生物群落结构也不相同。不同香型白酒酒醅中的微生物种类及数量也不尽相同，清香型白酒酒醅较浓香型与酱香型而言，酒醅中微生物种类、数量较少，种群结构以细菌为主，霉菌与酵母菌次之。细菌类中主要有乳酸菌、醋酸菌、芽孢杆菌等；霉菌类中主要有根霉、毛霉、红曲霉等；酵母菌类中主要有酵母菌属、汉逊酵母和假丝酵母等。在固态白酒发酵过程中，酵母菌对产酒、产酯、生香等都有着重要的作用。

金种子酒业技术人员利用清香型发酵酒醅为筛选源，采用变色圈平板初筛，发酵力复筛，并结合乙酸乙酯生成能力测定、麸曲培养检测、固态发酵产风味代谢物质分析等，筛选出高产乙酸乙酯酵母菌Jmx-01[7]。酵母菌Jmx-01的菌落及其美蓝染色的镜检(40×)结果如图3所示，其单菌落形态呈圆形、有隆起、乳白色、边缘不整齐、易挑取、黏稠，长时间培养将呈暗黄色，具有酵母菌菌落的典型形态特征；其菌体呈长椭圆形，可见出芽繁殖形成的芽体。

2.4 酿酒环境微生物

酿酒环境微生物是影响白酒品质、风味的重要因素，酿酒环境是指在白酒酿造过程中直接或间接接触的环境，它包含空气、酿造使用的设备、工具、厂房地面等等。随着技术的进步，人们对于白酒方面的研究也越加全面，对于酿酒环境微生物也有了更深入的探索，如唐玉明等[8]对曲房上中下不同位置空气微生物进行分析，发现空气中酵母菌和细菌与大曲中酸度呈显著相关。曹达等[9]研究表明不同高度的酱香型酿酒车间空气中的微生物含量及组成存在差异，这种差异会影响大曲质量。张良等[10]比较了泸州老窖作坊内外空气中细菌组成，认为芽孢杆菌是空气中主要的细菌种群。事实证明，长期开展生产的车间内已形成一定多样性、与酿造环境相适应、相对稳定、有益于酿酒的微生物群落。

3 功能性酿酒微生物在酿酒副产物综合利用等方面的应用

白酒行业的副产物资源化再利用既符合国家节能减排的政策导向，也能为企业创造一定的经济效益。酒糟的再发酵不仅产品安全性高，而且符合国家环保政策，丢糟酒与基础酒的融合性也好，不会出现使用外加物容易导致的浮香、味短、香味协调性差等问题，对保障和提高酒体质量也有较大益处。白酒行业的副产物资源化再利用既可应用在传统固态白酒中，满足国家标准中不得加入非自身发酵物质的规定，也能在新型白酒生产中使用。

3.1 利用酒糟制备有机饲料

白酒酿造中所产生的酿酒副产物酒糟，颜色呈浅褐色，味道具有发酵谷物的特点。酒糟不仅含有相当比例的无氮浸出物、还含有丰富的粗蛋白（见表1），经过加工制备的有机饲料作为牛和羊的主要饲料有很好的适口性和容易消化的特点，这是农作物秸秆所不能比拟的，而且还能有效预防牛羊发生瘤胃膨气，是一种物美价廉饲喂牛羊的饲料原料[11]。

表1 酒糟的分析检测结果

分别以浓香型白酒酒糟和清香型白酒酒糟原料进行对比性实验，添加黑曲霉麸曲、细菌麸曲、酵母麸曲等进行堆积糖化发酵，待发酵结束后，再添加其他营养成分，烘干粉碎后得到微生物菌体蛋白饲料。黑曲霉麸曲中富含纤维素酶、糖化酶、淀粉酶等，在发酵过程中，其能很好地分解酒糟中的植物粗纤维素、残余淀粉等；细菌麸曲中的蛋白酶等，可以分解酒糟中的粗蛋白等，有利于为酵母等微生物的生长繁衍提供物质基础；酵母麸曲经过扩大繁殖，产生大量的酵母菌体蛋白，菌体蛋白含有丰富的氨基酸等营养元素，并有助消化、改善饲料的适口性等。

3.2 利用酒糟回窖发酵制备丢糟酒

将现代生物工程技术与传统酿造发酵技术相结合，利用自转化育种功能性菌株及各种酿酒发酵有益菌株，研制开发出各类新型微生物菌剂，既可有效利用和降低各类白酒生产原材料中残余淀粉含量，提高酿酒原料的利用率，增加出酒率，减少废弃丢糟的排放；还可根据不同消费群的饮食文化的嗜好，采用不同微生物菌种配合和工艺改造，生产出具有不同风格特点的新产品类型，实现经济、社会及环保效益的和谐统一。借助白酒微生态研究构建的白酒菌种库及信息资源库，运用现代生物工程技术实现传统酿酒工艺中废弃物资源的高效利用。将传统制曲工艺与复合酶、复合酵母配合技术相结合，制作而成的具有较高的产酯能力和出酒率的丢糟专用酿酒微生物制剂，其酿造生产的丢糟酒风格独特，长期贮存后可以作为特殊调味酒使用，提高了酒企丢糟利用的综合效益，还有利于实现酒糟的综合循环利用，进一步解决酒糟处理污染环境的问题。

3.3 利用黄浆水制备生物酯化液

黄浆水是固态发酵白酒的副产物，呈棕黄色，是黏稠的混合物，其中含有丰富的有机物、粗淀粉、微生物菌体等。黄浆水在经过简单处理后可以用于勾调酒、强化窖泥保养、沼气发酵等，还可以利用黄浆水中的大量有机酸制备生产饮料、利用黄浆水中的微生物菌体制备生产微生物菌体蛋白饲料等。在酿酒工艺方面，可以利用黄浆水制备人工窖泥、制备酯化液、强化粮醅发酵等，利用黄浆水制作香醅再用于固态发酵，利用黄浆水进行己酸菌的驯化培养再制备己酸菌液体或人工窖泥使用，黄浆水的综合利用价值较高。黄浆水中含有大量氨氮化合物、糖类、酸、醇、酯等呈香物质以及有益微生物群（见表2），其中，酸（如乙酸、丁酸、乳酸）、酯（如乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯）、杂醇油等含量很高，直接利用难以实现。如何间接利用黄浆水提高产酒的质量及减少环境的污染成为很多酒厂急需解决的技术难题。

通过液体培养获得黑曲霉种子液，再向液态体系中添加适量的黄浆水、酒尾、食用酒精、大曲粉、酒醅、酯化红曲、复合己酸菌液等物料，并调整pH值，控制液态发酵温度及时间，获得可用于白酒酿造生产的酯化液，并将酯化液应用于灌窖或串蒸工序中，以提高浓香型白酒的质量。通过微生物液态发酵制备酯化液，充分利用黑曲霉液态发酵产生的复合酶类促进酯化作用，提高了液态发酵体系的酯化效率，并有效利用酿酒副产物中的有机酸、酯类等物质，在提高资源综合利用率等方面起到了积极作用。

表2 黄浆水主要成分的常规理化分析检测结果

利用黑曲霉与黄浆水及其他副产物制备的生物酯化液，能够很好地利用黄浆水中的有益成分。图4为黄浆水原样(a)与处理后排放样(b)的色谱图，由图4可知：经过处理利用后排放的黄浆水中，乳酸、乙酸、杂醇油的含量很高，排放的黄浆水中含有大量对酿酒生产无益的物质，此时排放的黄浆水再经污水生化处理，可大大减轻原污水处理设备的压力，减少了环境污染，同时也为企业增加了经济效益。

4 讨论与总结

图4 黄浆水原样(a)与处理后排放样(b)的色谱图

通过对窖泥、酒醅、大曲及酿造环境等部分功能性酿酒微生物的筛选、鉴定，并研究其代谢特征与机制，开展液体发酵产香分析、生产应用评价等研究。根据功能性酿酒微生物的代谢机理，通过液体扩培、人工窖泥、强化制曲等方式，实现对关键功能性酿酒微生物及特种功能性酶类的有效控制，调控白酒固态混合发酵体系代谢产物，丰富白酒中特色风味物质，提高生产效率和产酒品质。功能性酿酒微生物的研究及其应用，有助于对固态发酵白酒风味物质的特征及其形成机理进行分析，并结合现代风味化学研究，应用微生物生香发酵工程，调控窖池内酿造微生物的发酵、生香过程，实现对形成风味物质的功能性酿酒微生物及其代谢途径的调控，可以为增强浓香、清香等固态发酵白酒的典型风格、口感特色及其品质特征提供依据，将满足我国白酒酿造生产的现实需求，进而产生较好的经济和社会效益。功能性酿酒微生物在酒糟、黄浆水等酿酒副产物的综合利用等方面起到积极的推动作用，有助于解决酿酒行业的环境污染等问题，发展酿酒循环经济，促进白酒产业及其绿色酿造生产的长远发展。