嗜铁细菌地衣芽孢杆菌CAS20对柿树的防病促生作用
2019-07-02余贤美侯长明张坤鹏翟浩王洁马亚男安淼艾呈祥
余贤美 侯长明 张坤鹏 翟浩 王洁 马亚男 安淼 艾呈祥
摘要：通过盆栽试验和离体叶片接种试验，研究嗜铁细菌地衣芽孢杆菌CAS20对柿树的防病促生作用。经浸种和灌根处理，CAS20可使柿树幼苗分别增高76.72%和50.00%;在对峙平板中产生的抑菌带宽为0.57cm;对柿树炭疽病菌菌丝生长和孢子萌发抑制率分别为92.94%和83.91%。离体叶片接种试验结果显示，先接种CAS20菌悬液再接种菌饼和先接种菌饼再接种CAS20菌悬液，对柿树炭疽病的离体防效分别为77.01%和69.35%，说明CAS20可能通过产生诱导系统抗性提高对柿树炭疽病的防治效果。本研究结果表明，CAS20在防病促生方面具有良好的应用潜能。
关键词：嗜铁细菌;地衣芽孢杆菌;促生作用;柿树炭疽病;防治效果
中图分类号：S432.4+4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）05-0120-05
地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）是一种革兰氏阳性细菌，属于常见的芽孢杆菌属，可通过产生生物活化酶促进植物生长、增加产量[1]，对黄瓜枯萎病[2]和桃枝枯病[3]有良好的生防效果，对桃褐腐病菌[4，5]、黄瓜疫霉病菌[6]、番茄叶霉病菌[7]等病原真菌有较强的抑制活性，在促进植物生长和防治植物病害领域有非常突出的应用价值[1，8-10]。
柿樹炭疽病是危害柿树的一种毁灭性病害，发生严重时可导致植株死亡，常造成重大经济损失，已成为阻碍柿产业发展的重要因素[11-13]。通过研究嗜铁细菌地衣芽孢杆菌CAS20对柿树幼苗生长、柿树炭疽病菌菌丝生长和孢子萌发的影响，明确了CAS20菌株的防病促生作用，以期为柿树炭疽病的防治提供新的思路和途径。
1材料与方法
1.1供试菌株
嗜铁细菌地衣芽孢杆菌CAS20和柿树炭疽病菌（Colleltrichumhorii），均由本课题组分离保存。
1.2CAS20的防病促生作用
1.2.1菌悬液的制备将CAS20接种到LB液体培养基中，于37℃、150r/min条件下振荡培养过夜后稀释1000倍继续振荡培养2h，10000r/min离心5min，去上清，用10mmol/L的无菌硫酸镁溶液制成1×1010cfu/mL的菌悬液。
1.2.2生长促进作用设置2个处理：（1）CAS20菌悬液稀释10倍（终浓度为1×109cfu/mL）用于浸泡柿种子48h;（2）以清水浸泡柿种子，待柿子幼苗移栽到盆钵后，按菌悬液与土壤1∶9的比例进行灌根接种，使接种后土壤中的菌体数约为1×109cfu/g，以清水浸泡柿种子和浇灌为对照，每处理10棵幼苗，重复3次。不定期浇水，以满足幼苗生长的需要，2个月后测定柿树幼苗的株高，按照以下公式计算CAS20的生长促进作用。
幼苗增高百分率（%）=（处理幼苗株高-对照幼苗株高）/对照幼苗株高×100
1.2.3拮抗试验通过平板对峙法，在平板中央接种直径为0.5cm的柿树炭疽病菌菌块，四周对称接种CAS20，28℃条件下培养7d，测量抑菌带宽并求其平均值。
1.2.4对菌丝生长和孢子萌发的影响采用菌丝生长速率法和孢子萌发法，分别测定CAS20对柿树炭疽病菌菌丝生长和分生孢子萌发的影响。
菌丝抑制试验：在无菌条件下，取100μL（1×109cfu/mL）CAS20菌悬液，用三角玻璃棒均匀涂抹在PDA培养基平板上，待菌液吸干后，将直径0.5cm的柿树炭疽病菌菌饼接种于培养基平板中央，以不涂抹菌悬液为对照，重复3次。接种后28℃恒温倒置培养5d，用十字交叉法测量菌落直径并求平均值，根据以下公式计算CAS20对柿树炭疽病菌菌丝生长抑制率。
菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100
孢子萌发试验：取10μL（1×1010cfu/mL）CAS20菌悬液和90μL（每毫升1×106个孢子）柿树炭疽病菌孢子悬浮液，混匀后滴于洁净的单凹载玻片上，25℃恒温培养，以无菌水为对照。培养8h后，在显微镜下观察分生孢子萌发情况，根据以下公式计算CAS20对柿树炭疽病菌孢子萌发的抑制率。
孢子萌发抑制率（%）=（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率×100
1.2.5离体叶片接种试验采集无机械伤、无病虫害的健康柿树嫩叶，以无菌大头针刺伤叶片，设置以下2种接种方式：（1）喷雾接种CAS20菌悬液，2d后将柿树炭疽病菌菌饼接种于伤口处;（2）将柿树炭疽病菌菌饼接种于伤口处，2d后喷雾接种CAS20菌悬液。每个处理接种30片叶子，以接种菌饼+喷施无菌硫酸镁溶液为对照，重复3次。28℃保湿培养，第7d统计发病情况。参照邓维萍等[14]的方法测定病斑面积S，具体分级标准为：0级（-），不发病;1级（+），S≤1cm2;2级（++），1cm2
发病率降低百分率（%）=（对照发病率-处理发病率）/对照发病率×100
病情指数=Σ（各级病叶数×相应病级）/（叶片总数×最高病级）×100
防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100
2结果与分析
2.1CAS20的生长促进作用
浸种处理和灌根处理均极显著增加了柿树幼苗的株高（图1），柿树株高分别增加了8.9cm和5.8cm，增高百分率为76.72%和50.00%;浸种处理和灌根处理的柿树幼苗株高达到极显著差异（P<0.01）（表1）。说明越早使用菌液处理，CAS20对植物的生长促进作用越大。
2.2CAS20对柿树炭疽病菌的拮抗作用
接种柿树炭疽病菌菌饼和CAS20菌株后，28℃条件下培养7d，在对峙平板上产生了明显的抑菌带（图2），抑菌带宽为（0.57±0.05）cm，说明CAS20对柿树炭疽病菌具有较强的拮抗作用。
2.3CAS20对柿树炭疽病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用
CAS20对柿树炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发具有较强的抑制作用，菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率分别为92.94%和83.91%（表2）。
2.4CAS20对柿树炭疽病菌的离体防效
CAS20极显著降低了柿树炭疽病的发病率和病情指数，达到了良好的防治效果。其中，先接种CAS20菌悬液再接种柿树炭疽病菌菌饼的发病率显著低于先接种柿树炭疽病菌菌饼再接种CAS20菌悬液，二者分别降低了54.76%和46.42%，防治效果分别为77.01%和69.35%，差异显著（P<0.05）（表3），说明该菌株有可能通过产生诱导系统抗性，提高对柿树炭疽病的防治效果。
3讨论与结论
地衣芽孢杆菌由于具有防治植物病害、促进作物生长和提高作物产量的作用[1，8-10]，越来越多地受到关注。含地衣芽孢杆菌生物活化酶的磷肥，施用后在土壤中能达到分解磷的效果，可为作物前期提供有效磷，促进苗期快速生长，还可满足中后期对有效磷的需要，使养分供应与作物生长同步，同时还可固氮、解钾、改良土壤结构，提高化学利用率，从而大幅度增加大豆株高（4.6cm），显著提高大豆产量（单株荚数平均增加2.5个，百粒重平均增加2g左右）[1]。本试验发现，经浸种和灌根处理，CAS20极显著增加了柿树幼苗株高，浸种处理对幼苗株高的增加作用更为显著，说明早期使用菌液处理可加强菌株对植物的生长促进作用。
王春晓等[7]发现，未离心的地衣芽孢杆菌NJWGYH833051发酵液可以有效抑制番茄叶霉病菌，当剂量为106cfu/mL时对番茄叶霉病菌的菌丝生长抑制率达87.15%，略低于多菌灵药剂的抑菌效果。地衣芽孢杆菌W10菌液及其抗菌蛋白能明显抑制桃褐腐病菌和桃枝枯病菌的菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长，对贮藏期桃褐腐病有较好的抑制作用，能明显推迟桃果发病时间，降低贮藏期自然腐烂率，抑制病斑扩展[3-5]。
本试验中，CAS20对柿树炭疽病菌具有较强的拮抗作用，在对峙平板中产生的抑菌带宽为0.57cm，对菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为92.94%和83.91%。离体叶片接种试验结果显示，CAS20菌悬液显著降低了柿树炭疽病的发病率，先接种CAS20菌悬液后接种柿树炭疽病菌菌饼和先接种柿树炭疽病菌菌饼后接种CAS20菌悬液的防治效果分别为77.01%和69.35%，差异达到显著水平，说明CAS20有可能通过产生诱导系统抗性[15]，提高对柿树炭疽病的防治效果。
纪兆林等[4]研究发现，地衣芽孢杆菌W10（1×109cfu/mL）菌液对桃褐腐病菌的孢子萌发抑制率达100%，稀释5倍的无菌滤液对菌丝生长抑制率为85.2%，稀释2倍的无菌滤液产孢抑制率为84.0%;高汝佳[3]研究结果表明，2×109cfu/mL的W10菌液对桃枝枯病菌的生长抑制率为100%，1×109cfu/mL菌液完全抑制了病菌孢子萌发，而5×108cfu/mL菌液对孢子萌发的抑制率也高达80%以上。本试验在同等菌液浓度（1×109cfu/mL）条件下，CAS20对柿树炭疽病菌菌丝生长和孢子萌发抑制率略低于高汝佳[3]和纪兆林等[4]的结果，但均高于80%，说明CAS20对柿树炭疽病菌亦具有较强的拮抗作用，但因病原菌不同，其抑制率略有差异。另外，CAS20对病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制率低于33.5%喹啉铜悬浮剂、25%溴菌腈乳油、70%代森锰锌可湿性粉剂、70%代森联水分散粒剂、400g/L氟硅唑乳油和50%福美双可湿性粉剂等[16]，与王春晓等[7]的结果一致。但从对土壤生态环境的影响及长远考虑，生防菌株的应用比化学农药更具有优势，也更利于农业生产的可持续健康发展。
本试验结果表明，CAS20在防治植物病害和促进植物生长方面具有良好的应用潜能。对于该菌株在田间对柿树生长促进作用和对柿树炭疽病等病害的防治效果有待进一步研究。
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