植物生长调节剂优化不同品种冬小麦成熟胚再生体系

姚富泉 董鲁浩 王悦 李兴国 王芳 别晓敏

摘要：小麦愈伤组织再生能力是遗传转化的重要基础。为优化小麦成熟胚再生体系，以科农199、轮选987和济麦22三个冬小麦品种的成熟胚为外植体，在愈伤组织分化阶段添加不同浓度的植物生长调节剂TDZ（N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲，thidiazuron），统计和分析分化率。结果表明，TDZ最适响应浓度存在品种间差异，科农199、轮选987和济麦22成熟胚愈伤组织分化的最适TDZ浓度分别为1.5、1.0、0.5mg/L，愈伤组织分化率分别为84.61%、71.88%和71.77%，均极显著高于对照。本研究结果可为优化冬小麦成熟胚愈伤组织再生体系提供参考。

关键词：植物生长调节剂;TDZ;成熟胚;冬小麦;再生体系

中图分类号：S512.1+1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）05-0019-05

随着分子生物学的发展，生物技术育种手段日趋完善，但再生效率低、遗传转化困难仍是提高小麦（TriticumaestivumL.）遗传转化效率的瓶颈。已有研究发现，影响小麦组织培养再生频率的主要因素包括外植体[1，2]、基因型[3，4]、培养基类型[5-7]等。

改良培养基是提高小麦再生频率的手段之一，添加植物生长调节剂可以达到提高小麦成熟胚再生频率的目的。作为植物生长调节剂，N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲（thidiazuron，TDZ）对体细胞胚胎发生等具有重要作用，还具有调节其他植物激素和生理活性物质的作用[8]。Huetteman和Preece[9]发现低浓度TDZ可通过去除顶端优势诱导器官发生，促进不定芽或侧芽的形成。在植物离体培养过程中，无论是外植体脱分化形成愈伤组织，还是愈伤组织经过器官发生途径或胚状体途径形成再生植株，都是激素协同作用的结果[10]。在多种植物培养体系中添加TDZ都能诱导愈伤组织的形成，而且细胞增殖速率大大高于添加其他植物生长调节物质[11]。

目前小麦遗传转化所用外植体主要有幼胚、成熟胚、花药和胚轴等[1，2，12-16]。与其他外植体相比，成熟胚具有取材方便、不受季节限制、可大量获得、操作简单等优点，已得到广泛应用，然而再生频率较低是其应用的主要限制因素之一[14]。有研究表明植物生长调节剂预处理对小麦成熟胚的出愈率无显著影响，但能够显著促进愈伤组织分化[17]。培养基中添加TDZ对冬小麦成熟胚愈伤组织再生能力影响的研究尚未见报道。本试验通过研究TDZ对科农199、轮选987和济麦22成熟胚分化效率的影响，明确小麦成熟胚再生的最适TDZ浓度，为提高小麦成熟胚再生效率提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

选用冬小麦商业栽培品种科农199、轮选987和济麦22，均由山东农业大学生命科学学院植物发育分子生物学实验室保存并提供。秋季在山东农业大学试验基地种植，第二年六月份收获成熟种子进行试验。

1.2培养基成分和TDZ浓度设置

成熟胚预培养用Adi培养基，愈伤组织诱导用XCSX培养基，愈伤组织分化用XCFH培养基[7]（表1）。在小麦成熟胚分化阶段设置添加不同浓度TDZ处理，分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L，以不添加TDZ的培养基做对照，每个浓度梯度设置3个重复，每个重复接种25个外植体。所有培养基均在1.1kg/cm2（121℃）条件下高压灭菌15min。

1.3成熟胚培养

选取成熟饱满的小麦种子，在超净工作台上先用70%乙醇表面消毒10min，无菌水冲洗1次，再用25%次氯酸钠灭菌25min，无菌水冲洗3次，置于25℃培养箱中过夜。次日早晨，再用25%次氯酸钠灭菌15min，无菌水冲洗5次，将成熟胚刮碎后接种于Adi培养基上，25℃黑暗条件下培养7d后，转移到XCSX培养基上弱光培养14d，胚性愈伤组织及时转移到XCFH培养基上进行光照培养（光照强度3500lx，光周期为16h光照、8h黑暗）[7]。

1.4数据统计

小麦成熟胚愈伤组织在分化培养基培养14d后统计分化率，并进行方差分析。愈伤组织分化率（%）=分化出绿点的愈伤组织数/接种外植体数×100。

试验数据利用DPS6.85软件采用Tukey法进行统计分析。

2结果与分析

2.1不同浓度TDZ对科农199成熟胚愈伤组织分化率的影响

添加TDZ处理的科农199小麦成熟胚愈伤组织分化率均极显著高于对照，且随着TDZ添加浓度的升高，愈伤组織分化率呈现先高后低的趋势，在添加浓度为1.5mg/L时愈伤组织分化率达到84.61%的最高值，与2.0、2.5mg/L浓度处理相比有极显著差异，与0.5mg/L浓度处理相比达到显著性差异水平（表2，图1）。表明TDZ在0.5～2.5mg/L范围内对科农199成熟胚愈伤组织诱导出芽具有正向调控作用，0.5～1.5mg/L低浓度的促进效果更显著。

2.2不同浓度TDZ对轮选987成熟胚愈伤组织分化率的影响

随着TDZ添加浓度的升高，轮选987的愈伤组织分化率呈现先高后低的趋势，在添加浓度为1.0mg/L时愈伤组织分化率达到71.88%的最高值，与其他添加浓度相比达到极显著差异水平;其次为1.5mg/L添加浓度，愈伤组织分化率为65.17%，也极显著高于其他浓度。添加浓度为0.5、2.0、2.5mg/L时，愈伤组织分化率与对照无显著性差异（表2，图2）。可见，轮选987成熟胚愈伤组织在1.0～1.5mg/LTDZ处理时分化率显著提高。

2.3不同浓度TDZ对济麦22成熟胚愈伤组织分化率的影响

添加TDZ可以显著提高济麦22成熟胚的愈伤组织分化率（表2，图3）。在添加浓度为0.5mg/L时，愈伤组织分化率达到71.77%的最高值，显著高于其他处理;其次为1.5、1.0mg/L添加浓度，愈伤组织分化率明显高于其余浓度处理;添加浓度为2.0mg/L和2.5mg/L的愈伤组织分化率较低。结果表明，添加0.5～1.5mg/LTDZ对济麦22成熟胚愈伤组织分化率的提高幅度较大。

3讨论与结论

TDZ是人工合成的植物生长调节剂，具有促进细胞分裂和植株再生的能力，有利于不定芽或侧芽的形成，可以代替生长素或者细胞分裂素来诱导体细胞胚胎发生[8，9，18]。作为一种有效的形态发生调节剂在植物组织培养快繁体系中得到了广泛应用，应用范围遍及草本植物和木本植物，许多被认为难以诱导植株再生的植物种类都可以对TDZ产生应答[19]。

单独使用TDZ即可诱导花生（Arachishypogaea）体胚的发生，表明TDZ有类似生长素的生物学功能[20]。Mok等[21]以棉豆（Phaseoluslunatus）和烟草（Nicotianatabacum）愈伤组织为外植体研究发现，TDZ具有相当于甚至超过腺嘌呤类细胞分裂素的活性。在诱导天竺葵（Pelargoniumhortorum）体细胞胚胎发生时，TDZ的添加引起乙烯水平升高，推测TDZ可能通过乙烯途径影响植物再生能力[22]。此外，徐华松等[23]发现在TDZ诱导体细胞胚胎发生时脯氨酸也起到关键作用，推测TDZ诱导体细胞胚胎发生的作用机制也可能与胁迫反应有关。以上研究说明，TDZ在促进植物再生过程中，通過调节内源植物生长激素起作用[11，24]。

本研究以3个冬小麦品种的成熟胚为外植体，在诱导愈伤组织出芽过程中添加0.5～2.5mg/L的TDZ，发现TDZ低浓度添加可以明显提高3个冬小麦品种的愈伤组织分化能力，但不同品种对TDZ添加浓度的响应不同。在本试验条件下，科农199、轮选987、济麦22的最适TDZ添加浓度分别为1.5、1.0、0.5mg/L。本试验结果可为提高冬小麦成熟胚愈伤组织再生能力提供参考。

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