清蒸大黄的炮制及其五种游离蒽醌的含量测定分析

曾海生 陈勇 谢臻

摘要：采用HPLC法测定清蒸大黄中的5种游离蒽醌的含量。色谱柱为Thermo BDS HYPERSII C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸（76∶24）水溶液为流动相，检测波长为254 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。结果表明，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别在0.020 7～0.414 0 μg（R2=0.999 9）、0.172 1～3.442 0 μg（R2=0.999 6）、0.020 3～0.406 0 μg（R2=0.999 9）、0.148 0～2.960 0 μg（R2=0.999 8）、0.164 0～3.280 0 μg（R2=0.999 3）的线性范围内呈良好线性关系，说明该方法可作为大黄及其不同炮制品的质量控制方法。

关键词：清蒸大黄;游离蒽醌;炮制;高效液相色谱法

中图分类号：O657.7+2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）07-0111-04

大黄属中药泻下药，始载于《神农本草经》，历代本草均有收载。大黄为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum L.）、唐古特大黄（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或药用大黄（Rheum officinale Baill.）的干燥根和根茎[1]。掌叶大黄和唐古特大黄被称为北大黄，主产于青海和甘肃等地;药用大黄称为南大黄，主产于四川、陕西等地[2]。中国有大黄45个品种和2个亚种，但2015版《中国药典》只收录3种大黄，即正品大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根及根茎，主要有效成分有芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、没食子酸、番泻苷类、鞣质、大黄多糖和微量元素等[3，4]。大黄性苦、寒，归脾、胃、大肠、心、肝经，药理作用广泛，如泻下、消炎、抗菌、抗病毒、利胆、止血、降血脂、降血压等[5，6]。

除了使用生品外，也常使用炮制品，根据医院临床用药的需要，大黄需炮制成不同炮制品。大黄含有多种有效成分，在加热蒸炒炮制过程中，其所含有效成分含量变化很大，药理药效随之发生变化。根据辨证施治的需要，合理选用不同的炮制品，才能提高中医用药的疗效，避免产生毒副作用[7-10]。试验采用HPLC法同时测定清蒸大黄中5种游离蒽醌成分，为综合评价清蒸大黄的药材质量提供方法。

1  材料与方法

1.1  仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，包括2489UV、四元泵、真空脱气泵、自动进样器、柱温箱和Empower3液相工作站;PRACTUM224-KNSOP电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司];HWS-26电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.2  试剂

甲醇，色谱纯（美国Fisher科学世界公司）;甲醇、乙醇，分析纯（国药集团化学试剂有限公司）;醋酸镁（国药集团化学试剂有限公司）;磷酸（国药集团化学试剂有限公司）;超纯水，其他试剂均为分析纯。芦荟大黄素（批号：160520）、大黄酸（批号：170219）、大黄素（批号：170224）、大黄酚（批号：160124）、大黄素甲醚（批号：160602），纯度>98%，均购于上海融禾医药科技有限公司。

1.3  方法

1.3.1  清蒸大黃  取洗净生大黄片放入蒸制容器内，置水锅上，加热蒸约4 h，表面显微黑棕色，取出[11，12]，晒干或烘干（图1）。

1.3.2  色谱条件  Thermo BDS HYPERSIIC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-0.1%磷酸（76∶24），检测波长254 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。

1.3.3  对照品溶液制备  分别精密称取芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚12.94、 12.69、14.34、12.33、13.67 mg，加入甲醇溶解，芦荟大黄素和大黄素分别定容至25 mL容量瓶中，大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚分别定容至10 mL容量瓶中，即得各对照品储备液。

分别精密量取芦荟大黄素和大黄素对照品储备液1 mL，大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚对照品储备液3 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，即得混合对照品溶液，即芦荟大黄素20.70 μg/mL，大黄酸172.08 μg/mL，大黄素20.30 μg/mL，大黄酚147.96 μg/mL，大黄素甲醚164.04 μg/mL。

1.3.4  供试品制备  取清蒸大黄粉末约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2  结果与分析

2.1  色谱条件

按照“1.3.2”色谱条件，各组分分离度良好（图2）。

2.2  线性关系考察

分别精密吸取大黄混合对照品溶液1、2、5、8、12、15、20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，分别以峰面积和进样量（μg）为纵坐标和横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。精密吸取上述大黄混合对照品稀释液进样，测定其信号（以峰高计算）与噪声比值，将S/N=3时的浓度定为检测限（LOD），将S/N=10时的浓度定为定量限（LOQ）。各组分在各自的含量范围内线性关系良好（表1）。

2.3  方法学考察

2.3.1  精密度试验  精密量取混合对照品溶液适量，按“1.3.2”条件连续进样6次，分别记录各自的峰面积，并计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD。结果测得混合对照品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD值分别为0.70%、0.70%、0.37%、0.35%和0.42%，RSD都小于3.0%，表明所用液相色谱仪的精密度较好。

2.3.2  稳定性试验  取清蒸大黄粉末0.5 g，按“1.3.4”方法制备清蒸大黄供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24 h，按“1.3.2”条件依次测定各供试品的峰面积，结果测得清蒸大黄中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.36%、0.39%、0.46%、0.25%、0.24%，其RSD值均小于3.0%，说明24 h内供试品溶液稳定性良好。

2.3.3  重复性试验  精密称取清蒸大黄药材粉末6份，各0.5 g，按“1.3.4”方法制备清蒸大黄供试品溶液，按“1.3.2”条件依次测定各供试品的峰面积，计算大黄不同炮制品中芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚平均含量，结果测得其含量分别为0.941 2、2.230 7、1.512 0、3.206 7、4.063 4 mg，其RSD值均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.4  加样回收率试验  精密称取清蒸大黄药材粉末9份，各0.25 g，分成3组，即低、中、高加样组，每组分别加入混合对照品溶液（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚），按“1.3.4”方法制备清蒸大黄供试品溶液，按“1.3.2”条件测定，计算清蒸大黄低、中、高加样组中的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均回收率及其RSD值，结果见表2。由表2可知，该方法准确性良好。

2.4  样品含量测定

称取清蒸大黄药材粉末（过2号筛）0.5 g，3份，按“1.3.4”方法制备成供试品溶液，按“1.3.2”条件测定，采用外标一点法计算大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，结果见表3。

3  讨论

3.1  流动相的选择

试验采用HPLC测定大黄游离蒽醌类成分，对其流动相进行了考察，发现流动相中加入不同种类的酸对5种游离蒽醌的分离有较大影响。本试验采用甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%冰醋酸溶液和甲醇-0.1%冰醋酸溶液等流动相进行比较，结果表明，甲醇-0.1%磷酸溶液（76∶24）作为流动相，5种游离蒽醌分离效果较好，与杂峰达到基线分离。

3.2  炮制品与其对应的药理相关性分析

在蒸制的过程中，蒸气加热，温度高，破坏了主要泻下成分的结合型大黄酸，使其泻下作用下降;  而大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的增加，抑制血小板凝集作用，降低血小板活性，凝集状态得到改善，渗透压趋于正常。因此，清蒸大黄相对于生大黄来说，活血祛瘀的功效更好。生大黄经炮制后，其药效发生了改变，治疗范围扩大[13-15]。同时，经过蒸制，清蒸大黄对胃肠道刺激较生大黄有所下降。不同的中药炮制方法产生不同的炮制品，其治疗效果也会产生差异，所以临床上要辨证施治。

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