胰腺癌患者癌组织与血清中klotho的表达水平及其临床意义

黄曙 周海浪 王敏 范志宁

1涟水县人民医院消化科，淮安 223400；2江苏省人民医院消化内镜中心，南京 210029

klotho是1997年发现与衰老相关的基因[1]。近年来一些研究表明klotho还与人类肿瘤的发生密切相关，如结肠癌、胰腺癌、宫颈癌、肝细胞癌等[2-6]。Abranovitz等[7]报道，胰腺癌中klotho可以通过抑制胰岛素和类胰岛素生长因子-1(IGF-1)以及成纤维细胞生长因子(FGF)信号通路发挥肿瘤抑制物的作用。本研究检测胰腺癌组织和血清klotho的表达水平，分析其与胰腺癌病理参数及患者预后的关系，探讨klotho作为胰腺癌肿瘤分子标志物的临床意义。

材料与方法

一、胰腺癌组织芯片

包含79例胰腺癌组织及其配对的癌旁正常胰腺组织的组织芯片由上海芯超生物技术有限公司提供(编号OD-CT-DgPan01-006)，每片芯片的完整性>95%。79例者中男性47例，女性32例，年龄37～76岁，平均59岁。根据国际抗癌联盟(UICC)TNM分期，Ⅰ期35例，Ⅱ期9例，Ⅲ期35例。术后起一直随访至患者肿瘤复发死亡为止，随访时间2～61个月，平均27个月。

二、胰腺组织klotho蛋白表达检测

采用免疫组织化学EnVision二步法检测组织芯片中klotho蛋白的表达，严格按照说明书操作。山羊抗人klotho多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，工作浓度为1∶100，以细胞的胞质或胞核出现棕黄色颗粒为阳性表达。根据染色强度与阳性细胞数综合计分。染色强度：无染色、淡黄色、棕黄色、褐色分别计1、2、3、4分；阳性细胞百分数：<25%、25%～<50%、50%～<75%、≥75%分别计1、2、3、4分。两分相乘即为总分，≤4分为阴性， >4分为阳性。

三、患者血清klotho水平测定

收集2016年1月至2017年12月间涟水人民医院住院的39例胰腺癌患者血清，同时采集39例与其临床资料相匹配的健康者血清作为对照组。采用ELISA法检测血清分泌型klotho蛋白水平，试剂盒购于日本Immuo-Biological Lab公司。测定的最低值为6.15 pg/ml，批内和批间变异系数为2.7%～9.8%。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

四、统计学处理

结 果

一、胰腺癌组织klotho蛋白阳性表达率及其与肿瘤临床病理参数的关系

胰腺癌组织klotho表达阳性率为59.5%(47/79)，癌旁组织阳性率为96.3%(77/80)，胰腺癌组织阳性率明显低于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=31.282，P<0.001，图1)。胰腺癌组织klotho的蛋白表达与胰腺癌的临床分期及淋巴结转移呈负相关, 而与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、局部侵润深度等无相关性(表1)。

二、胰腺癌组织klotho表达与患者预后的关系

胰腺癌klotho蛋白阳性表达与患者预后呈正相关，klotho蛋白阳性及阴性患者组的中位生存期分别为(48.31±6.94)个月(95%CI34.710～ 61.909)、(19.50±6.78)个月(95%CI6.206～ 32.794，图2)，阳性组显著长于阴性组，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 胰腺癌组织(1A)及癌旁正常组织(1B)的klotho蛋白表达(HE ×400)

临床病理资料例数klotho的表达情况阳性(%)阴性χ2值P值年龄(岁) ≥603823(50.0)150.0740.786 <604023(64.3)17性别 女3219(59.4)130.0000.986 男4728(59.6)19肿瘤大小(cm) ≤45231(59.6)210.2720.976 >42715(59.3)13肿瘤位置 胰腺头部5131(60.8)292.1690.765 胰腺体部52(40.0)3 胰腺颈部和体部11(100.0)0 胰腺体部和尾部137(53.8)6 胰腺尾部43(75.0)1 胰腺头部至尾部42(50.0)2TNM分期 Ⅰ期3526(74.3)95.8530.047 Ⅱ期95(55.6)4 Ⅲ期3516(45.7)19淋巴结转移情况 无3929(74.4)105.7260.017 有3416(47.1)18浸润深度 T132(66.7)10.3130.940 T26740(59.7)27 T395(55.6)4

图2 胰腺癌klotho蛋白表达阳性及阴性患者的术后生存期

三、胰腺癌患者血清klotho水平

胰腺癌组、对照组外周血清klotho水平分别为(670.30±82.24) 、(310.35±34.65)pg/ml，胰腺癌组显著高于对照组，差异具有统计学意义 (t=25.5，P<0.001)。通过对影响受试者和对照组血清klotho水平的潜在混杂因素分析，表明差异无统计学意义(表2)，提示检测结果可靠。

表2 影响胰腺癌患者血清klotho表达的潜在因素

绘制klotho水平的ROC曲线，其曲线下的面积为0.859，临界诊断值为376.51 pg/ml(图3)。诊断胰腺癌的敏感度为84.6%，特异度为87.2%。

图3 胰腺癌患者血清klotho水平的ROC曲线

klotho基因于1997年被发现[1]，最先的研究认为它是一种抗衰老基因，因klotho基因敲除的小鼠出现了过快衰老的症状，如骨质疏松、皮肤萎缩、动脉硬化等，且生存期明显缩短，而klotho基因高表达的小鼠则表现为生存时间延长[8]。近年来对klotho基因的功能研究提示其与恶性肿瘤的发生发展亦密切相关。klotho能抑制多种恶性肿瘤相关信号通路如insulin/IGF-1、Wnt/β-catenin、TGF-1等，从而抑制肿瘤细胞的生长与迁移，这些结果在乳腺癌、肝癌、肾癌中得到证实[5, 7, 9-10]。但是Lu等[11]在卵巢上皮细胞癌中的研究结果却提示klotho蛋白表达可能与卵巢癌进展有关，而并非发挥抑癌因子样作用，说明klotho基因在不同的肿瘤中可能发挥着不同的作用。

Abramovitz等[7]采用免疫组织化学法检测了5例正常胰腺组织与18例胰腺癌组织klotho蛋白的表达，正常胰腺组织klotho表达阳性率为100%，显著高于胰腺癌组织的17%；癌组织klotho mRNA表达也显著低于癌旁组织。细胞模型的研究发现klotho基因可以通过抑制IGF-1/FGF通路发挥抑癌基因的作用。本结果显示，胰腺癌组织klotho蛋白表达阳性率明显低于癌旁组织，胰腺癌组织klotho蛋白表达与胰腺癌的临床分期及淋巴结转移呈负相关,胰腺癌组织klotho表达阳性患者的生存期明显长于klotho表达阴性的患者。

目前可以通过ELISA法检测人血中分泌型klotho蛋白，且试剂盒已商业化，如通过测定肾病、糖尿病患者与健康老人血清分泌型klotho蛋白的水平，分析分泌型klotho蛋白相应的临床意义[12-14]。本研究也使用ELISA法检测了胰腺癌与其匹配对照组血清分泌型klotho水平，结果显示胰腺癌患者血清分泌型klotho水平显著高于对照组。结合klotho在胰腺癌组织中低表达的研究结果，似乎存在矛盾之处，推测其原因可能与胰腺癌的肿瘤微环境有关。因胰腺癌细胞周围的间质异常致密，可发挥“屏障”作用，使分泌型klotho蛋白不能接触癌细胞，从而不能发挥其抑癌作用，进而外周血中klotho浓度代偿性升高，此种现象也见于肝癌[15]。通过ROC曲线分析，诊断胰腺癌的血清klotho的临界值为376.51 pg/ml，敏感度为84.6%，特异度为87.2%，可以作为诊断胰腺癌及判断预后的指标之一。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突