海藻糖鉴别（3）、有关物质、含量的测定方法验证

李宁 刘昶 李镇宏

摘 要：建立一个用高效液相色谱法测定海藻糖鉴别（3）、有关物质和含量测定的方法。方法：以磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子氢型色谱柱 ;以水为流动相 ;检测45℃，柱温80℃，流速0.4ml/min。结果：海藻糖在1.0027472～15.04419mg/ml浓度范围内线性关系良好，得线性方程y=0.0000022x-0.037297（R2=0.9999），回归系数大于0.999;  结论：该方法简便、准确，可用于海藻糖鉴别（3）、有关物质和含量的质量控制。

关键词：海藻糖;高效液相色谱法示差检测器;方法学

海藻糖是一种对生物体具有神奇的保护作用的二糖，它能够有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。所以海藻糖在食品、药品和化妆品领域都有广泛的应用。特别是在医药领域今后几年需求量会有较大的增长。而海藻糖的鉴别、有关物质和含量的检测是用高效液相RID检测器检测，RID检测器为特殊检测器，应用不是很广泛。本文拟建立海藻糖鉴别（3）、有关物质和含量测定的方法，旨在为海藻糖的质量安全提供参考。进一步确立海藻糖的使用安全。

1.实验部分

1.1试剂与仪器

海藻糖、麦芽三糖、无水葡萄糖对照品 来源 中国食品药品检定研究院。纯化水，自制。海藻糖样品。

安捷伦1260高效液相色谱仪系统（配有示差折光检测器、四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱）。电子天平：梅特勒托利多电子天平（XS105DU）。

1.2试验方法

色谱条件与系统适应性  以磺化交联的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子氢型色谱柱;以纯水为流动相 ;示差折光检测温度为45℃，柱温80℃，流速0.4ml/min，采集运行30min。

对照品溶液的制备  精密称定麦芽三糖、无水葡萄糖、海藻糖对照品，分别为24.41mg、24.26mg、93.06mg，置于同一个10ml量瓶中，加水溶解并稀释制成每lml中各含2.441mg、2.424mg、9.287mg的溶液为对照1，再精密称定海藻糖对照品252.20mg置于25ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度制成每1ml含海藻糖10.027mg的溶液为对照2。精密吸取20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，各色谱峰之间的分离度均大于1.5。

供试品溶液的制备  取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每lml约含海藻糖lOmg的溶液。摇匀，用0.45？m滤膜过滤，取续滤液作为供试品。

测定法：  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20？l，注入色谱仪，测定，即得。

精密度试验：分别精密吸取浓度为9.287mg/ml的海藻糖对照品溶液按测定方法对对照溶液1重复进样6次测定峰面积值。各次测得的峰面积值分别为4178000、4174140、4177330、4177290、4176290、4175530，平均值为4176430，RSD为0.03%相对标准偏差小于2.0%，仪器精密度良好。

线性关系与线性范围考察：精密称定海藻糖对照品151.35mg置于10ml量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得到浓度为15.04mg/ml的溶液作为海藻糖对照品储备液和浓度为10.027mg/ml的海藻糖对照品制成1.0027mg/ml、2.0054 mg/ml、5.0137mg/ml、7.5220 mg/ml、10.0274mg/ml、15.0441mg/ml6个浓度的溶液，分别取上述6个浓度的对照品溶液20ul注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积;以面积为纵坐标，以对照品浓度（mg/ml）为横坐标作线性回归，绘制标准曲线。

试验结果表明：海藻糖线性回归方程为y=0.0000022x-0.037297（R2=0.9999），相关系数满足要求，说明海藻糖在1.0027472～15.04419mg/ml范围内线性关系良好。

重复性试验：取1批海藻糖原料（批号：2018001），取供试品6份，精密称定，依含量测定方法测定，同时，取海藻糖对照品溶液同法测定，分别计算出海藻糖含量，RSD為0.38%。

加样回收率试验（准确度试验）：采取全程加样法。取9份已知含量的海藻糖约0.046g，精密称定，置于10ml量瓶中。1-3份精密量取海藻糖对照溶液2各3.00ml加入到量瓶中， 4-6份精密量取5.00ml到量瓶中，7-9份精密量取7.00ml于容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。得到80%、100%、120%浓度的供试品，按含量测定方法测定，同时取海藻糖对照品溶液，依法测定，并计算出海藻糖的含量。以下式计算回收率。试验结果，平均回收率为99.8%（RSD=0.62%）。结果较满意，表明本法适用于海藻糖的质量控制。

2.结论： 通过对按照《中国药典》2015年版四部，第555页海藻糖项下的鉴别（3）、有关物质和含量的测定方法，进行系统适用性试验、精密度试验、检测限、专属性、线性关系与线性范围考察、重复性试验、准确度试验（加样回收试验），各项试验测试结果均能满足要求，仪器性能稳定，准确度结果满意。

从以上数据可以看出用该方法检测海藻糖的鉴别（3）、有关物质和含量，结果准确可靠，表明运用此方法检测海藻糖可以安全有效的控制海藻糖的质量。

该方法中海藻糖的检测限为0.10027472ug.海藻糖的线性范围为1.0027472～15.04419mg/ml。