蓖麻饼粕蛋白酶解及毒素去除工艺研究

2019-06-28冀照君穆莎茉莉张继星

安徽农业科学 2019年10期

冀照君穆莎茉莉张继星

摘要蓖麻饼粕经105 ℃烘干2 h并粉碎至40目后，采用中性蛋白酶对蓖麻饼粕蛋白进行酶解，采用响应面法对酶解工艺进行了优化。结果表明，当酶用量为6.2 IU/mg（以物料质量计）、底物浓度（物料蛋白∶水）为6.0% 、温度为45 ℃、pH为7.4、水解3.8 h时，蓖麻蛋白水解效果较好，水解度达8.16%。经冷水浸提过滤及离心处理，所得蛋白酶解液中蓖麻碱去除率为83.19%，其他毒素未检出。该酶解工艺有效去除了蓖麻毒素，进一步拓宽了蓖麻饼粕的利用空间。

关键词蓖麻饼粕;蛋白酶;酶解;毒素

中图分类号 TS209文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）10-0156-04

Abstract Castor meal was smashed to 40mesh at 105 ℃ for 2 h，and hydrolyzed with neutral protease.Then response surface methodology was used for optimizing the hydrolytic conditions.The results showed that good hydrolytic effectiveness was obtained and the degree of hydrolysis （DH） reached 8.16%，under the optimal conditions of enzyme dosage 6.2 IU/mg （calculated by material quality），substrate concentration 6.0% （the rate of protein to water），temperature 45 ℃，pH 7.4 and reaction time 3.8 h.The removal rate of ricin was 83.19% and the content of other toxins was not detected in protein hydrolyzates，which was extracted by cold water and centrifuged.The enzymatic hydrolysis technology could remove ricin effectively，and further broaden the availability of castor cake meal.

Key words Castor meal;Protease;Enzymolysis;Toxin

蓖麻（Aicinus communis L.）属大戟科蓖麻属喜温植物，种质资源十分丰富[1]。蓖麻籽粒经榨油后所得的废弃物称为蓖麻饼粕。Gionbelli等[2]研究发现蓖麻饼粕中尚存在4种毒素物质，即蓖麻毒蛋白、血球凝集素、变应原和蓖麻碱，严重阻碍了进一步的加工利用，主要被当做农田肥料施加到田间，只有少量添加到动物饲料中[3-4]。为了开拓蓖麻饼粕的在食品工业中的利用空间，很多学者对蓖麻饼粕的成分进行了分析。研究发现，蓖麻饼粕除含有粗纤维、碳水化合物外，还含有丰富的粗蛋白（含量高达33%～35%）、多种矿物质元素（如钙、锌、铁等），是一种天然的优质资源[5]。蓖麻饼粕的脱毒工艺研究一直是学者们关注的问题[6-8]，迄今已研究出多种蓖麻饼粕的脱毒方法[9]。但关于蓖麻饼粕粗蛋白的再利用研究报道甚少，2015年于丽娜等[10]首次采用蛋白酶对蓖麻蛋白进行了酶解处理并测定了产物的抗氧化特性，但未测定产物中毒素的含量。蓖麻饼粕中除蓖麻碱外，其他毒素分子中均含有蛋白质长链结构，高温变性后很容易受到蛋白酶分解而去除，纯蓖麻碱则微溶于冷水，可以通过低温离心法去除[11]。笔者采用蛋白酶在最适条件下对高温变性后的蓖麻饼粕进行处理，不仅可以破坏毒素的分子结构，去除毒素，而且还能使蛋白质转变为肽或氨基酸，易于消化吸收，分解后的蛋白质可以很好地溶于水中，然后将水解液冷却离心，得到无毒的蓖麻水解粗提液。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。蓖麻饼粕，购自通辽通化化工有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备。PHS-3C型精密pH计，为上海精密科学仪器有限公司产品; KDN-04C型凯氏定氮仪，为郑州南北仪器设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 总氮量的测定。总氮量的测定采用微量凯氏定氮法[12]。

1.2.2 氨基氮含量的测定。氨氢氮含量的测定采用甲醛滴定法[13]。取5 mL蓖麻饼粕蛋白酶解后产物，加入60 mL蒸馏水并搅拌10 min。用已标定的0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH为8.2，并保持1 min，缓慢加入甲醛10 mL并搅拌3 min。然后，再次滴定至溶液pH为9.2，记氢氧化钠标准溶液体积为V1。

同时，取另外5 mL酶解前的蓖麻饼粕溶液作为空白对照，按照上述方法进行滴定，记氢氧化钠标准溶液体积为V0。按照以下公式计算氨氨基氮含量：

式中，V1为滴定酶解后产物消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）;V0为滴定酶解前溶液消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）;C为氢氧化钠标准溶液浓度;14.008为氢氧化钠中氮当量常數，单位为mg/mL;5为所取样品的体积，单位为mL。

1.2.3 水解度的计算。

采用水解度作为蓖麻饼粕蛋白酶解工艺优化的指标，水解度的计算公式[14]如下：

1.3 工艺流程及操作要点。

1.3.1 工艺流程。工艺流程如图1所示。

1.3.2 主要操作要点。

1.3.2.1 原料烘干及粉碎。

由于榨油后的蓖麻饼粕中含有一定的水分，并且颗粒较大，因此需要将饼粕进行初步烘干并粉碎至所需的粒度。将蓖麻饼粕于105 ℃下烘干2 h，采用高速粉碎机粉碎至40目[15]，待用。

1.3.2.2 酶解。

将上述预处理原料中加入蒸馏水制成一定浓度的混合物，然后匀浆处理，底物浓度（以物料中蛋白质含量所占百分比计）分别为3%、4%、5%、6%、7%;调节pH，加入一定量的中性蛋白酶在设定好的温度下进行酶解，酶用量分別为3、4、5、6、7 IU/g，以水解度为指标，研究蓖麻蛋白酶解的最佳工艺条件。每个处理重复3次，试验结果均取3次重复的平均值。

1.3.2.3 灭酶。

灭酶的目的是防止酶解过程影响水解度的测定结果。采用90 ℃加热5 min的方式，以灭掉蛋白酶的活性。

1.3.2.4 粗肽液分离及毒素检测。

酶解后，将混合物进行8层纱布过滤，然后缓慢冷却至2～4 ℃，使蓖麻碱逐渐形成不溶性晶体而析出，通过冷冻离心（8 000 r/min，10 min）去除不溶解成分，取上清液即为粗肽液，血球凝集素、蓖麻毒蛋白、变应原的提取及检测采用高效液相色谱法[16]，蓖麻碱的检测采用紫外分光光度法[11]。

1.4 试验设计

在单因素试验的基础上，经分析发现在酶解过程中酶用量、底物浓度、酶解温度、酶解时间对酶解效果的影响较为显著，而pH对酶解效果的影响较小，因此以酶用量、底物浓度、酶解温度和酶解时间4个因素为自变量（x），以水解度为响应值（Y），利用Design-Expert 7.1软件的中心旋转组合设计[17]，共进行31个试验点，取3次平行试验的平均值。中心旋转组合因素与水平设计见表1。

1.5 数据统计与分析使用Design-Expert 7.1软件和Excel 2010软件对试验数据进行统计与分析。

1.6 模型的验证

通过响应面分析法（response surface methodology，RSM）优化蓖麻饼粕酶解的工艺条件，并在模型预测的最优条件下再次对蓖麻饼粕蛋白进行酶解，比较预测值和试验过程中的测定值来验证模型适用于该研究的程度。

2 结果与分析

2.1 回归模型的拟合中心旋转组合设计试验结果见表2。

蓖麻饼粕蛋白酶解工艺采用RSM优化法建立了相应的数学模型，蓖麻饼粕蛋白水解度的回归方程如下：

通过上述回归模型计算出的蓖麻饼粕蛋白水解度预测值Y与实际试验过程中所测定得到的水解度进行拟合，结果见图2。从图2可以看出，该回归方程所计算的预测值与实际测定值拟合良好，因此该方程可用于评估蓖麻饼粕蛋白的酶解工艺参数和酶解结果。

2.2 自变量对响应值的影响

蓖麻饼粕蛋白酶解后所得水解度受回归方程中回归系数的影响。由表3可知，x1、x2、x3、x4、x3x4、x12、x22、x32、x42项对水解度有显著影响，其他因素的影响不显著。根据回归方程的原理，一次项回归系数对水解度的影响最大，其绝对值大小依次分别为x4、x1、x2、x3。这表明影响蓖麻饼粕蛋白水解度最主要因素为酶解时间，其次为酶用量、底物浓度、酶解温度。为了形象地描述各因素对响应值的影响，各因素对水解度影响的响应值见图3～8。

2.3 最适条件和回归模型的验证

通过该回归模型，采用Design expert 7.1软件优化蓖麻饼粕蛋白酶解条件，得出最适工艺条件：酶用量6.2 IU/mg、底物浓度6.0%、酶解温度45 ℃、酶解时间3.8 h，并调节pH至7.4，在此条件下蓖麻饼粕蛋白水解度的预测值为8.20%，而实际测得的水解度为8.16%，实际值与预测值之间的相对误差为0.04%，差异不显著。

将粗提液采用高效液相色谱法进行测定后，发现蓖麻毒蛋白、变应原、血球凝集素的毒素均未检出，蓖麻碱去除率为83.19%。因此，采用RSM法优化得到的工艺条件可以有效去除蓖麻饼粕中的各种毒素。

3 结论与讨论

蓖麻饼粕作为蓖麻籽榨油后的废弃产品，绝大部分作为肥料施加到田间[5，9]，只有少量饼粕添加到动物饲料[6，9]，造成了严重的资源浪费，因此蓖麻饼粕的再利用一直备受研究者们的关注。烘干并粉碎后的蓖麻饼粕经中性蛋白酶处理后，水解度可达8.16%。采用水洗法去除了酶解产物中83.19%的蓖麻碱，其他毒素均未检出。该研究中酶用量和底物浓度对蓖麻饼粕水解度的影响较为显著，蓖麻饼粕经过105 ℃烘干后，蓖麻毒蛋白、血球凝集素、变应原及其他蛋白质分子结构中的蛋白质部分已变性，酶结合位点充分暴露，中性蛋白酶可以有效降解蛋白质大分子[10]，分解为多肽或氨基酸含量较高的酶解产物，这与大豆蛋白酶解过程相似[19]。该试验中酶解时间对蓖麻饼粕蛋白水解度的影响也很大，这可能是由于蓖麻饼粕中部分蛋白质结构较为复杂，如糖结合蛋白[4]，酶反应速度相对缓慢。另外，采用已有的水洗法去除酶解产物残存的蓖麻碱，可避免其他营养成分的丢失[11]。总而言之，采用酶解的方法对蓖麻饼粕进行处理，不仅可以去除毒素，而且丰富了酶解产物的营养成分，易于消化吸收，极大地拓宽了蓖麻饼粕的进一步利用空间。

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