解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶及其酶解能力相关研究进展

戴圻霏 张斯童 孙旸

摘要 纤维素是地球上丰富的天然生物聚合物，是重要的可再生有機资源，在农作物秸秆中尤为丰富。纤维素、半纤维素和木质素混合组成木质纤维素，木质纤维素结构的复杂性限制自然界中大量秸秆的降解。纤维素酶是将纤维素降解成葡萄糖的一类酶的总称，主要作用于纤维素及其衍生物，在木质纤维素转化利用方面发挥核心作用。解淀粉芽孢杆菌是一类具有纤维素酶合成能力的细菌，其合成的纤维素酶具有产酶条件简单，培养周期短，酶活力高的特点，因此具有广泛的应用价值和前景。对近年来产纤维素酶解淀粉芽孢杆菌的筛选与发酵工艺及其特性进行综述，以期为纤维素酶的生产和应用提供理论帮助。

关键词 解淀粉芽孢杆菌;木质纤维素;纤维素酶

中图分类号 TQ925文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）10-0014-04

Abstract Cellulose is a rich natural biopolymer on the earth. It is an important renewable organic resource and is especially abundant in crop straw.Lignocellulose consists of a mixture of cellulose，hemicellulose and lignin.But the complexity of lignocellulosic structure limits the degradation of large amounts of straw in nature.Cellulase is a general term for a class of enzymes that degrade cellulose into glucose. It mainly acts on cellulose and its derivatives and plays a central role in the conversion and utilization of lignocellulose.Bacillus amyloliquefaciens is a kind of bacteria with cellulase synthesis ability. Its synthesized cellulase has the characteristics of simple enzyme production conditions，short culture period and high enzyme activity. So it has wide application value and prospect.In this paper，the screening，fermentation process and characteristics of cellulaseproducing Bacillus amyloliquefaciens were reviewed in order to provide theoretical help for the production and application of cellulase.

Key words Bacillus amyloliquefaciens;Lignocellulose;Cellulase

秸秆是由纤维素、半纤维素和木质素混合组成的。由于秸秆茎叶表皮角质层和硅细胞的阻抑、纤维素链分子结晶结构的高抗蚀性等限制因素的存在，使其难以利用。纤维素是植物秸秆的三大重要成分之一，其主要的成分是由葡萄糖组成的大分子多糖[1]。纤维素在自然界中分布十分广泛，并且是含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上[2]。目前，纤维素是全球最为丰富的可再生生物资源，其开发利用被认为是对秸秆能源回收再利用方面问题重要关键点。21世纪以来，能源问题越来越得到重视并且日益严峻，所以纤维素的开发和利用也成为目前研究的热点，降解纤维素的方法很多，一般采用物理、化学、微生物法，但是物理和化学法因为生产成本高、环境污染等问题导致效果并不是十分理想。与之相比，具有反应条件温和易控等优点的生物降解法就备受青睐，纤维素酶能够有效降解纤维素，纤维素酶在分解纤维素时起生物催化作用，纤维素是800～1 200个葡萄糖分子聚合而成，它可以将纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质。因此，可通过微生物发酵产纤维素酶降解秸秆中的纤维素，用于提高畜禽生产性能，提高秸秆利用率，改善饲料的营养价值，降低能源成本和提高经济效益，具有广阔的开发前景，今后应进一步加强纤维素酶研究和开发工作[3]。因此，筛选出高产纤维素酶菌株成为开发利用纤维素资源的核心工作。

解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，属革兰阳性芽孢杆菌[4]，菌落在多种固体培养基上均不产生荧光素。在LB培养基上呈淡黄色不透明菌落，可以合成多种纤维素酶，酶活力较高的是羧甲基纤维素酶和滤纸酶活，并且具有促进木质纤维素分解的能力。并且该细菌生长速度快，繁殖能力强，培养方式单一，产纤维素酶能力较强[5]。解淀粉芽孢杆菌对秸秆中纤维素再利用具有潜在的前景和价值。

1 纤维素酶

1.1 纤维素酶的来源与应用

关于纤维素酶的研究[6]，早在1906年从蜗牛消化液中被发现，20世纪50年代Reese等提出C1-Cx假说来解释对纤维素酶的作用方式，80年代中后期开始利用基因工程的方法对纤维素酶的基因进行克隆并测定出一级结构，90年代初开始探究厌氧细菌纤维小体超分子，并更深一层的探究其复合体结构功能，现如今已经进入分子时代，开始探究纤维素酶的基因以及氨基酸[7]。一些产纤维素酶微生物和一些分泌纤维素酶原生动物是纤维素酶主要来源，真菌是目前工业生产更是纤维素酶的主要菌种，其中丝状真菌以木霉属、曲霉属和青霉属为主，纤维素酶产量高于其他微生物，所以被广泛使用于纤维素酶产业化生产。其他的真菌、细菌和放线菌也可以产纤维素酶[8]。产纤维素酶的细菌主要有梭状芽抱杆菌、白色瘤胃球菌，所产纤维素酶是胞内酶或吸附于细胞壁上，但是其酶活力与真菌相比较低一些，所以细菌产纤维素酶产业化开发受到一定的影响[9]。放线菌产纤维素酶主要包括链霉菌和弯曲高温单孢菌等，其中链霉属、高温放线菌属等酶活较高，但因产酶量相对较低且生长缓慢，所以近国内外详细研究较为困难。纤维素酶的主要应用是生物抛光、生物石料、生物整理等纺织工业，食品工业中的淀粉加工、谷物酒精发酵、啤酒和酿酒业酿造、麦芽、提取和加工等，在农业上主要用于控制植物病原体和疾病在农业上，还有在家里洗衣服的洗涤剂，改善织物的柔软度和亮度等[10-12]。

1.2 纤维素酶的成分与作用机制

纖维素酶是3种酶混合在一起的总称：①内切葡聚糖酶（endo-1，4-β-D-glucanase，EC.3.2.1.4，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Cen），作用于纤维素的非结晶区，主要水解纤维素长链中的β-1，4糖苷键，把纤维素大链分解成大量不同聚合程度的并且还带有非还原端的纤维素短链[13];②外切葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-glucanase，EC.3.2.1.91，又称纤维二糖水解酶，来自真菌简称CBH，来自细菌简称Cex） ，与内切葡聚糖酶相辅相成，作用于纤维素的结晶区，水解微晶纤维素分子中的还原端和非还原端的 β-1，4糖苷键并且释放出大量的二糖;③β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC3.2.1.21，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶，简称BG），主要水解纤维二糖和可溶性寡糖，生成葡萄糖[14]，这是按照催化功能把纤维素酶分成了三大类。这3种酶相互协调共同作用在纤维素上，使纤维素长链最终水解成葡萄糖，如图1所示。

2 解淀粉芽孢杆菌

最早由Priest 发现并鉴定出解淀粉芽孢杆菌，其经典模式菌株为ATCC23350，自然界分布十分广泛，在堆肥、土壤、植物表面和动物体内、青贮玉米秸秆饲料、海洋赤潮甚至污水湖泊的底泥中均可发现并分离得到，并且根据国内外不断完善的菌种鉴定技术和鉴定方法和各种各样的生理生化特征从而得到不同种的解淀粉芽孢杆菌。该菌基本特征是在LB固体培养基上形成圆形、扁平、湿润有粘性的小菌落;在血琼脂平板上呈现比较明显透明溶血;在种子液中混浊生长，震荡后管底沉淀生长[15]，经革兰染色，呈阳性。在显微镜下可见两端钝圆并且长短不一的杆菌，形状状呈直或接近直，约有（0.3～2.2） μm×（1.2～7.0） μm，并有大于菌体的次末端芽胞。解淀粉芽孢杆菌在 90%乙醇中 72 h、1 000 mg/L的 84消毒液中 18 h 、20 g/L戊二醛中60 min仍可以存活。但是通过紫外线照射 30 min，121 ℃压力蒸汽灭菌 20 min，100 ℃煮沸 5 min都可以完全消灭其菌。此属菌的模式菌为枯草芽孢杆菌，其最高生长温度为 45～55  ℃，最低生长温度为5～20  ℃[16]，严格好氧可兼性厌氧。利用基因序列进行鉴定和分类的方法鉴定出其基因包括16S rDNA 和部分保守看家基因。目前，在 NCBI 中公布了大量解淀粉芽孢杆菌核糖体 16S rDNA 序列，可以作为参考序列进行种间的比较鉴定[17-19]，特别是近年来随着测序成本的降低，所以利用全基因组测序方法开展解淀粉芽孢杆菌的比较鉴定更为准确和清晰。

3 解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶的研究

结合国内外对解淀粉芽孢杆菌的研究，发现该菌可以降解秸秆，并可以作为分解纤维素能力较高的细菌，所以就目前来看解淀粉芽孢杆菌的选育是提高其纤维素酶酶活力研究的重点，利用合理的方法提高解淀粉芽孢杆菌的产纤维素酶和提高纤维素酶的稳定性是目前研究的热点，综合目前国内外的研究成果，对提高解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶活力的方法进行概括，以期为纤维素酶的生产提供技术指导。

3.1 产纤维素酶解淀粉芽孢菌的分离与突变

目前国内外针对解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶特异性的筛选方法已经非常成熟。李蘅香等[20]从沼气站的秸秆堆肥中分离筛到 1 株常温下产纤维素酶的菌株，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌 CEL-1，采用Plackett-Burman 试验设计使其纤维素酶酶活力达161.34 U/mL，比优化前提高了2.71 倍。刘宇等[21]从饲料样品中筛选产纤维素酶益生菌，并通过形态学和系统进化树方法鉴定分离菌。同时对培养时间、pH和温度等酶促反应条件进行了实验，最后经过16S rRNA鉴定其为解淀粉芽孢杆菌，该菌粗酶液的滤纸酶活为1.5 U/mL，林晓琼等[22]以玉米秸秆中的土壤里分离出的解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变系统（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）进行物理诱变，用96孔板高通量筛选法细筛产纤维素酶活力高的突变菌株，找出了一株遗传稳定性良好的突变菌株T-16。产纤维素酶活力达到 1.759 U/mL，比出发菌株提高了 41.8%。 综上所述，产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌多在土壤、饲料中以及秸秆表面容易发现并分离，同时不定向进化较为效果显著。

3.2 解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶发酵条件优化

解淀粉芽孢杆菌根据培养基配方及其比例的改变，从而改变该菌生长活力，也可以导致产纤维素酶的能力也有所改变。培养基中碳源、氮源、金属离子、接种量、培养时间、温度、pH、表面活性剂及转速等等因素都可以影响解淀粉芽孢杆菌的产纤维素酶的能力，所以可以通过试验进行优化提高其纤维素酶活力，从而适合大规模生产。姜军坡等[23]对解淀粉芽孢杆菌Tu-115菌株产纤维素酶液体发酵条件进行优化，使其发酵液中羧甲基纤维素活力达到最高值为18.43 U/mL，比优化前提高26.5倍。李红亚等[24]前期获得2株具有木质素和纤维素降解能力的解淀粉芽孢杆菌菌株的基础上，采用均匀设计法对解淀粉芽胞杆菌FJAT-8754产纤维素酶进行三因素四水平优化试验，在初始的发酵条件进行重新发酵，24 h后，玉米秸秆中木质素、纤维素和半纤维素的降解率分别达48.4%、30.5%和41.4%，优于单株解淀粉芽孢杆菌降解秸秆能力。所以解淀粉芽孢杆菌产纤维素酶的能力，对于秸秆饲草化利用中极具应用前景，对降解秸秆方面有一定的开发价值，对保护环境做出贡献。

3.3 对解淀粉芽孢杆菌纤维素酶基因的分子改造

早在20世纪90年代，Amold提出指定性进化技术，通过试管作为载体，并通过某种手段快速改造酶基因，从而达到目标酶某些理想性状大量提高的目的[25-27]。自定向进化技术发展以来，国内外许多研究者通过PCR技术改造目标酶，后期通过建立一定的筛选方法，筛选得到目标酶目标性状有所提高的酶基因[28]。陈玉娟等[29]通过PCR扩增获得β-葡聚糖酶的基因，用电转化的方法将其导入解淀粉芽孢杆菌B4801中，得到了能高效表达β-葡聚糖酶的重组菌株。该重组菌株在摇瓶发酵条件下的β-葡聚糖酶最高酶活为303 U/mL，是原始菌株酶活水平的11.84倍。15 L发酵罐发酵条件下胞外β-葡聚糖酶最高酶活为2 023 U/mL，是摇瓶发酵条件下酶活水平的6.67 倍。苗会[30]从解淀粉芽孢杆菌克隆得到内切葡聚糖酶基因，成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，通过易错PCR改造内切葡聚糖酶，通过高通量筛选，筛选出一株高产内切葡聚糖酶的菌株，其酶活测定显示，相比原始菌株高17%，其最适pH由原来的5.6偏移到6.5，在pH 7.0～9.0时仍保持70%以上。目前已克隆得到多种纤维素酶的基因，很多都源于细菌，且解淀粉芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌，相比真菌更容易进行基因的改造。

4 解淀粉芽孢杆菌益生特性

解淀粉芽孢杆菌不仅可以产纤维素酶，还具有其他诸多益生特性，很多学者根据不同益生特性的解淀粉芽孢杆菌菌株做出相关特异性试验。如对很多病菌具有抑制活性的抑菌蛋白 ba-ciamin，Wong等[31]从解淀粉芽孢杆菌NK10中通过分离纯化得到此抑菌蛋白，使病原真菌生物膜通透性同时还得到增加。解淀粉芽孢杆菌还可以通过自身分泌的次生代谢物质来促进和保护菌体在植物体内的丛集运动、生物膜形成、定殖和繁殖等[32-33]来实现对植物的相互作用。有些具有能够抑制使棉花枯萎病菌的生长特殊能力解淀粉芽孢杆菌，其菌株粗提液能够造成棉花枯萎病的病原菌的菌丝消融、变细，菌丝膜发生破裂，原生质体凝集渗漏，菌丝体扭曲变形，形成泡囊结构，孢子的产生受到严重抑制，从而使病原菌无法正常生长[34]。并且根据上文所述，解淀粉芽孢杆菌具有很强的生长能力和适应能力，并且广泛生存在土壤中和在植物中，该菌有多种优点，比如无不良反应、无残留、无污染、不产生耐药性等，所以解淀粉芽孢杆菌应用于益生菌制剂应用价值巨大，潜力无穷。

5 展望

我国农作物的秸秆蓄积量非常高，是极为丰富且能直接利用的可再生有机资源，但是我国秸秆的综合利用仅在很小的一部分，大多数的秸秆都被人为就地点燃焚烧或直接丢弃在田间地头，造成大量秸秆资源的浪费并且还污染环境[35-36]。在众多的秸秆利用技术中，微生物发酵技术因其能耗低，副产物少的优点，被广泛应用。由于秸秆中含有大量的木质纤维素，微生物发酵技术在木质纤维素的降解、菌体蛋白的富集以及有益代谢物的积累等方面就具有更为突出作用，其对环境友好及能源再生等优点近年来受到国内外科学工作者的广泛关注。

解淀粉芽孢杆菌作为可以产纤维素酶的细菌，在自然界分布广泛，易分离培养且易改造等优点，可以有助于改善环境，减少秸秆的焚烧。通过不同方法在提高解淀粉芽孢杆菌的酶活力的同时也降低产酶成本，并且借鉴国内外已有的研究成果，提高其产纤维素酶的酶活力，从而形成一个比较完善的木质纤维素利用系统，最终实现木质纤维素的分级利用，以达到节能减排和经济可持续发展的目标。

纤维素酶作为一种高分子复合酶，具有复杂的空间结构且不易分离、纯化的特点，生产工艺需要不断的研究和进一步的完善，所以选择优良的菌株是提高纤维素酶活力关键。解淀粉芽孢杆菌繁殖能力强且增殖速度快，容易筛选与分离，发酵周期短，在工业生产上可以通过液态发酵工艺产酶。解淀粉芽孢杆菌作为细菌提高产纤维素酶活力的方法众多，容易改造，在工业方面可以实现大规模生产。解淀粉芽孢杆菌不光具有产纤维素酶的特性，也还具备其他诸多的益生特性，所以解淀粉芽孢杆菌应用于秸秆降解和畜牧养殖业，不仅能提高秸秆回收利用率，还可以在医疗方面防虫治病，促进动植物生长，同时缓解能源方面具有巨大的压力，二次能源回收再利用具有很大的前景和应用价值。并且根据国内外目前所使用的方法可以提高解淀粉芽孢杆菌生产纤维素酶能力，为降低粮食加工副产物中纤维素含量、提高其利用率提供了参考。

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