一株溶磷解钾菌的分离筛选与鉴定

王勇 陈燕琼 温书恒

摘要 为获得具有高效溶磷解钾能力的菌株，采用选择性培养基从柑橘根部土壤中分离筛选具有溶磷解钾作用的菌株，通过液体培养法进一步比较筛选菌株的溶磷解钾能力，选择溶磷解钾能力强的菌株进行形态特征、生理生化特征、16S rDNA及gyrB基因同源性分析。结果表明，LW-1、LW-2、LW-3和LW-4这4株菌株具有解磷解钾作用;其中，LW-3的解磷解钾能力最强，其溶解无机磷量为19.06 μg/mL，相对增加38.64%，溶解有机磷量为17.06 μg/mL，相对增加28.57%，溶解钾量为33.59 μg/mL，相对增加15.96%;经鉴定确定菌株LW-3为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌LW-3，是理想的菌肥生产用菌株。

关键词 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌;解磷;解钾;筛选;鉴定

中图分类号 S182文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）10-0005-05

Abstract In order to obtain a strain of bacteria with efficient activity on solubilizing phosphate and potassium，strains were isolated by using selective medium in the root soil of citrus.The solubilization activity of strains were further compared by liquid culture method，then the strain with the strongest ability to dissolve phosphorus and potassium will be identified by the characteristics of morphological，physiological and biochemical tests and the homology analysis of 16S rDNA and gyrB genes.The results showed that there were four strains of LW1，LW2，LW3 and LW4 having the activity on solubilizing phosphorus and potassium on which the LW3 had the best performance.The strain of LW3 had inorganic phosphatesolubilizing content of 19.06 μg/mL，organic phosphatesolubilizing content of 17.06 μg/mL and potassiumsolubilizing content of 33.59 μg/mL，which relatively increased by 38.64%，28.57% and 15.96% respectively.The strain of LW3 was identified as Lysinibacllus fusiformis LW3 after a series of tests，which had most potentiality as fertilizerproducing bacteria.

Key words Lysinibacllus fusiformis;Phosphorus removal;Potassium removal;Screening;Identification

磷和钾是植物生长发育必需的营养元素，土壤磷、钾的供应直接影响作物的产量和品质。我国土壤中磷、钾的形态主要是不易被作物吸收利用的难溶性磷及矿物态钾，能供植物直接吸收利用的磷、钾资源极其有限[1]。为实现作物的增产增收，农业生产中长期大量施用磷肥、钾肥，造成土壤板结、环境污染、农药残留等一系列的生态环境问题和农产品质量安全问题[2]。由于水溶态磷进入土壤后易发生化学固定或吸附固定，使得磷肥當季利用率极低，仅为10%～25%[3]，大大降低了磷肥肥效。因此，寻找一种既能增加土壤磷、钾有效性，提高土壤肥力及磷钾肥利用效率又能减少环境污染的方法成为当前研究的热点。研究表明，将解磷菌、解钾菌制成相应的菌剂施入到土壤中，可以将土壤中难溶性磷和矿物钾释解为速效态磷、钾，提高磷、钾的有效化利用，减少化肥的施用量，促进植物生长，提高作物产量和改善品质[4-7]，同时微生物菌剂具有无毒、无污染的特点，既有化肥的效果，又能避免化肥的缺点，具有广泛的开发应用前景。为获得具有高效解磷解钾能力的菌株，笔者从柑橘根际土壤中分离筛选溶磷解钾菌，研究其溶磷解钾能力并进行菌种鉴定，以期为生物菌肥的研制提供理论依据和菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器与试剂。

主要仪器是隔水培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司），摇床培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司），恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司），高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），原子吸收分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）等;主要试剂是过氧化氢溶液、氢氧化钠溶液、硝酸溶液、钼锑贮存溶液、钼锑抗显色剂、二硝基酚指示剂、磷标准溶液、钾标准溶液等。

1.1.2 培养基。

活化培养基：营养琼脂（NA）或LB培养基。种子培养基：玉米淀粉3.00 g，蔗糖1.20 g，硫酸铵0.48 g，硫酸镁1.20 g，磷酸氢二钾1.20 g，氯化铁0.12 g，碳酸钙1.20 g，酵母粉0.60 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。解磷固体培养基：①解无机磷固体培养基为葡萄糖10.00 g，硫酸铵0.50 g，氯化钠0.30 g，硫酸镁0.30 g，硫酸亚铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，碳酸钙5.00 g，氯化钾0.30 g，磷酸三钙5.00 g，琼脂粉15.00 g，加蒸馏水定容至1 000 mL ，pH 7.0～7.5;②解有机磷固体培养基同无机磷固体培养基，但将磷酸三钙5.00 g替换为卵磷脂0.30 g。解钾固体培养基：蔗糖10.00 g，磷酸氢二钠1.00 g，硫酸铵0.50 g，硫酸镁1.00 g，酵母膏0.20 g，硫酸亚铁0.03 g，碳酸钙2.50 g，钾长石粉10.00 g，琼脂粉15.00 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。解磷液体培养基：①解无机磷液体培养基为葡萄糖10.00 g，磷酸三钙5.00 g，硫酸铵0.50 g，氯化钠0.20 g，氯化钾0.20 g，七水硫酸镁0.30 g，硫酸锰0.03 g，七水硫酸亚铁0.03 g，酵母粉0.50 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5;②解有机磷液体培养基同无机磷液体培养基，但将磷酸三钙5.00 g替换为卵磷脂0.30 g，并加碳酸钙5.00 g。解钾液体培养基为蔗糖10.00 g，七水硫酸镁0.50 g，硫酸铵0.20 g，氯化钠0.10 g，碳酸钙0.10 g，钾长石粉5.00 g，加蒸馏水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.5。培养基于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 溶磷解钾菌株的分离筛选。

从广东江门古井采集柑橘根部土壤，将土壤自然风干并研磨成粉得土壤样品。称取5.0 g土壤样品溶于装有45 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，150 r/min，30 ℃振荡20 min，得到10-1的土壤悬液，将土壤悬液置于80 ℃水浴锅中水浴30 min，然后用移液枪吸取1 mL至装有9 mL无菌水试管中，充分振荡成10-2稀释液，按无菌操作依次稀释成10-5稀释液。吸取100 μL稀释液分别涂布于解无机磷、解有机磷和解钾固体培养基上，于35 ℃培养箱培养，观察产生溶磷圈、溶钾圈的菌株，并挑取于NA培养基上进一步纯化，将各菌株重复平板溶磷解钾试验。最后将各纯培养菌株转入25%甘油管并保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 液体培养试验。

将保存的菌株于营养琼脂（NA）或LB培养基上活化培养24 h，挑取一环活化的各菌株分别接入50 mL种子培养基中，150 r/min、30 ℃摇床培养至稳定期，测定各培养液的OD600，并用无菌水将各培养液OD600稀释至相同后作为种子液;按5%接种量将种子液分别接种至100 mL 已灭菌的解无機/有机磷/钾液体培养基中，以不接种任何菌液的解无机/有机磷/钾液体培养基为对照（CK），3个重复，于30 ℃、150 r/min条件下培养7 d，制得解无机磷、解有机磷和解钾的摇瓶发酵液供解磷解钾能力测定。

1.2.3 解磷能力测定。

将解无机磷和解有机磷的摇瓶发酵液分别转入蒸发皿中，在水浴锅中浓缩至10 mL左右，加入2.0 mL 20% H2O2溶液，继续蒸发并不断搅动，直至黏性物质完全消化。将溶液转移至离心管中3 500 r/min离心10 min，将上清液收集至50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，以磷酸二氢钾为标准物质，按钼锑抗比色法[8]测定溶液中的磷含量，根据速效磷相对增加量衡量菌株的解无机磷和解有机磷能力。

1.2.4 解钾能力测定。

将解钾的摇瓶发酵液转入蒸发皿中，在水浴锅中浓缩至10 mL左右，加入2.0 mL 20% H2O2溶液，继续蒸发并不断搅动，如此反复至黏性物质完全消化。将溶液转移至离心管中3 500 r/min离心10 min，将上清液收集至50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，以KCl为标准物质，用原子吸收分光光度计测定溶液中速效钾含量。根据速效钾相对增加量衡量菌株的解钾能力。

1.2.5 菌株的鉴定。

选择解磷解钾能力最强的菌株进行鉴定。菌株培养性状的观察：按《细菌分类学》的细菌培养性状方法对菌株进行培养性状的观察。常规生理生化特征的测定：对菌株进行氧化酶试验、VP试验、明胶水解试验、产H2S试验、柠檬酸生长等试验。分子生物学特性测定：将纯化的菌株LW-3送至中国科学院微生物研究所进行16S rDNA及gyrB基因测序，获得测序结果后登陆美国国家生物技术信息所（national center for biotechnology information，NCBI）页面，使用Blast程序进行同源性比对分析，并通过MEGA 5.0软件采用邻接法建立菌株系统发育树。综合菌种的细胞形态、生理生化特征、16S rDNA序列及gyrB序列分析，确定菌株的属种。

2 结果与分析

2.1 溶磷解钾菌株的分离筛选结果

用解无机磷、解有机磷和解钾固体培养基共分离出4株溶磷解钾菌。对4株菌株编号为LW-1～LW-4，并重复平板溶磷解钾试验，测定溶磷透明圈（D）、解钾透明圈（D）及菌落直径（d），以D/d的大小初步判断菌株的解磷解钾能力[9]，结果见表1。由表1可知，LW-3和LW-4在解无机磷、有机磷和钾培养基上均产生透明圈，LW-1和LW-2分别在解无机磷和解钾平板上无明显透明圈产生。LW-3在解无机磷、有机磷和解钾平板上的D/d均比其他3株菌株的D/d大，初步断定LW-3的解磷和解钾能力最强。

2.2 解磷解钾能力 由表2可知，在解无机磷方面， LW-2、LW-3与LW-4菌株发酵液的速效磷含量相比CK显著增加，LW-1菌株发酵液的速效磷含量与CK无显著差异，其中，LW-3菌株发酵液速效磷含量高达49.33 μg/mL，解无机磷量为19.06 μg/mL，相对增加量最大，说明4株菌株中，LW-3的解无机磷能力最强，与平板解无机磷试验结果一致。在解有机磷方面，各菌株均具有明显的解有机磷效果，其中， LW-1与LW-2解有机磷能力无显著差异，LW-3菌株发酵液速效磷含量及相对增加量最大，分别为59.71 μg/mL和28.57%，解有机磷量为17.06 μg/mL，其解有机磷能力也最强，与平板解有机磷试验结果一致。在解钾方面，4株菌株的发酵液速效钾含量存在显著差异且高于CK的速效钾含量，但LW-2在解钾平板上无明显透明圈产生，原因可能是平板中钾浓度太大，使得LW-2的解钾效果无法显现;4个菌株发酵液中，速效钾含量最高的是LW-3菌株发酵液，达210.41 μg/mL，解钾能力最强。综合可知，4株菌株中，LW-3在解磷和解钾方面均表现最显著效果，解磷解钾能力最强，是生物菌肥研制理想的菌种资源。

2.3 菌株LW-3的鉴定结果

2.3.1 菌株LW-3培养形状。

2.3.2 菌株LW-3生理生化特征。

2.3.3 菌株LW-3分子生物学特性。

2.3.3.1 16S rDNA序列分析。

2.3.3.2 gyrB基因序列分析。

结合gyrB基因序列分析对菌株LW-3进一步确认，其gyrB基因系统发育树见图5。由图5可知，菌株LW-3与纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis RB-21，检索号：CP010820.1）的同源性达99%，因此，综合菌株的菌落及细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列、gyrB基因序列等分析，确定菌株LW-3为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌LW-3。

3 结论与讨论

从土壤中共分离得到4株溶磷解钾菌，液体培养试验结果显示，4株菌株中，菌株LW-3的解磷和解钾能力最强，溶解无机磷量为19.06 μg/mL，相对增加38.64%，溶解有机磷量为17.06 μg/mL，相对增加28.57%，溶解钾量为33.59 μg/mL，相对增加15.96%，是理想的菌肥生产用菌株，经鉴定确定该菌株为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌LW-3（Lysinibacllus fusiformis LW-3）。

除具有溶磷解钾作用外，研究表明，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌可产大量胞外多糖、氨基甲酸乙酯水解酶、植酸酶等有益物质，具有溶藻、降解原油、除铅、防治水稻纹枯病等特性[11-18]，对研究开发生物菌肥、生物农药、动物饲料添加剂、水体净化剂、土壤修复剂等具有重要意义，开发应用前景极其广阔。

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