响应面法优化野生五叶草莓总黄酮提取工艺

2019-06-28朱秀娟胡文斌宫峥嵘

四川轻化工大学学报(自然科学版) 2019年3期

孙娜，王华，朱秀娟，胡文斌，宫峥嵘

(陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃成县 742500)

五叶草莓(Fragaria Pentaphylla Losinsk) 为蔷薇科草莓属，又名森林草莓、瓢子，是一种多年生草本植物，广泛分布于我国秦岭山脉，资源丰富［1］，市价可观，十分畅销，是当地农民季节性收入的来源之一，其果实主要分为白色和红色两种［2］，具有清热止咳、滋养补血、健脾养胃等药用价值［3-4］。但五叶草莓个头较普通草莓小，易受挤压而破损，贮藏运输十分困难，这严重制约了其销售，造成较大资源浪费，故寻求五叶草莓的深加工方法对其开发与利用具有重要意义。

五叶草莓不仅营养价值高，而且含有多种化学活性物质，尤其是黄酮类化合物含量极高［5］。生物总黄酮又称黄酮类化合物，是广泛存在于植物界的一大类以黄酮为母体的天然有机化合物，广泛分布于蔬菜、水果、牧草和药用植物中，是植物产生的一类次生代谢产物。研究发现，黄酮类化合物具有抑菌、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、延缓衰老、降血糖、降血压、降血脂及抗炎镇痛等作用，目前已被广泛应用于食品、医药和化妆品等行业［6-8］。

五叶草莓是我国特有的一种野生草莓资源［9］，国内学者对其已有一定研究，但多是侧重于其人工栽培方面［10］，对其总黄酮类物质的提取却鲜有报道。目前对生物总黄酮的提取方法主要有水浸提法、乙醇浸提法、索氏提取法、渗透法、水蒸气蒸馏法、超声波提取法和酶法等。近些年天然活性物质提取多借助超声波辅助技术，其产生的强烈振动和空化效应等可有效破坏植物细胞壁，加速有效成分释放，具有缩短提取时间和提高产品提取率等优点［11-14］。为充分利用野生五叶草莓资源，本研究首次将超声波提取技术应用于五叶草莓黄酮的提取工艺中，利用Box-Benhnken 中心组合设计优化五叶草莓总黄酮提取工艺，旨在为五叶草莓总黄酮的提取及综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五叶草莓购自陇南成县市集。选取大小一致、无破损、无病虫害的新鲜五叶草莓，清洗沥干，放置于45 ℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒定，粉碎后过40 目筛，备用。

芦丁标准品购自成都格利普生物科技有限公司;石油醚、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯，购自西安化玻试剂有限公司。

KQ-700E 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ;SP-756P 紫外-可见分光光度计(上海光谱仪器公司) ; Buchi R-210 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ;GZX-9070MBE 型鼓风干燥烘箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ;400Y 型粉碎机(永康市展帆工贸有限公司) ;FA2004N 型电子天平(上海精密科学仪器有限公司) 等。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮提取工艺

准确称取2.00 g 五叶草莓干粉，用索氏回流法脱色、脱脂，按一定的液料比(mL/g) 加入一定浓度乙醇溶液，搅拌均匀，在一定温度下超声提取一定时间，真空抽滤，减压浓缩至20 mL，浓缩液用一定浓度的乙醇溶液定容至50 mL。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制与样品液总黄酮的测定

参照钱慧琴、丁峰等人［15-16］黄酮含量测定方法来制作标准曲线，分光光度计检测波长为510 nm，以芦丁标准溶液的质量浓度C 为横坐标，吸光度A 为纵坐标，制作标准曲线，结果见图1，所得标准曲线方程为: A =0.0119C+0.0005，R2=0.9995。

图1 芦丁标准曲线

取样品液与对照品溶液同法显色，在510 nm 波长处测其吸光度值［17-18］。将样品液吸光度代入标准曲线方程中，求得样品液中的总黄酮质量浓度C1。

1.2.3 总黄酮提取率计算公式

式中，C1为粗提液样品中五叶草莓黄酮质量浓度，mg/mL;N为稀释倍数，量纲为1;V1为粗提样液总体积，mL;V2为测定时取样体积，mL; M 为五叶草莓样品质量，g。

1.2.4 总黄酮提取工艺优化

(1) 单因素试验设计

设计单因素试验，分别考察液料比(mL/g) (5 ∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1) 、超声时间(15 min、20 min、25 min、30 min 和35 min) 、超声温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃) 和乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%和90%) 这4 个单因素对五叶草莓黄酮提取率的影响。

(2) 响应曲面(Box-Behnken) 中心组合试验设计

在单因素试验基础上，以五叶草莓黄酮提取率为响应值，进行Box-Behnken 的中心组合试验，进一步考察液料比、超声时间、超声温度及乙醇体积分数对总黄酮提取的影响，优化提取工艺。响应曲面试验因素与水平设计见表1。

表1 Box-Behnken 中心组合试验设计因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 液料比对五叶草莓黄酮提取率的影响

液料比对五叶草莓黄酮提取率的影响如图2 所示。

从图2 可知，随着液料比不断加大，五叶草莓黄酮提取率呈先升后降趋势，当液料比达到10∶1时，提取率达到最高。其原因可能是液料比达到10∶1时，五叶草莓黄酮已基本完全溶解在乙醇中，继续增大液料比，并不利于五叶草莓黄酮的提取，故从提取效率、减少成本等方面综合考虑，10∶1是合适的液料比。

图2 液料比对五叶草莓黄酮提取率的影响

2.1.2 超声时间对五叶草莓黄酮提取率的影响

超声时间对五叶草莓黄酮提取率的影响如图3所示。

图3 超声时间对五叶草莓黄酮提取率的影响

从图3 可知，五叶草莓黄酮提取率在超声时间为15 min ～25 min 内呈上升趋势，当超声时间达到25 min时，提取率最大，之后随着超声时间的延长，提取率却呈下降趋势。其原因可能是在超声处理的前期，超声波可有效破坏细胞壁，使活性成分黄酮类化合物释放出来，但随着时间的推移，持续的超声产生大量的热，使热稳定性差的黄酮类物质被破坏而导致提取率下降，故超声时间选取25 min 为宜。

2.1.3 超声温度对五叶草莓黄酮提取率的影响

超声温度对五叶草莓黄酮提取率的影响如图4所示。

图4 超声温度对五叶草莓黄酮提取率的影响

从图4 可以知，五叶草莓黄酮提取率在超声温度为40 ℃～60 ℃内缓慢上升，60 ℃时提取率达到最大，当超声温度超过60 ℃，提取率急剧下降。其原因可能是黄酮类化合物热稳定性较差，但当温度上升到一定值以后，会对其结构造成破坏，从而影响了五叶草莓黄酮提取率。所以，选择60 ℃为合适的超声温度。

2.1.4 乙醇体积分数对五叶草莓黄酮提取率的影响

乙醇体积分数对五叶草莓黄酮提取率的影响如图5所示。

图5 乙醇体积分数对五叶草莓黄酮提取率的影响

从图5 可知，在乙醇体积分数为50% ～60%范围内时，五叶草莓黄酮提取率随乙醇体积分数的增大而显著上升，乙醇体积分数为60 %时提取率最大，之后提取率开始下降，当乙醇体积分数超过70%以后，提取率又有所上升。其原因可能是黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态苷元形式存在，乙醇溶液与五叶草莓黄酮均属于极性物质，乙醇使黄酮易于被游离提取出来，但乙醇体积分数过大可能引起溶出的杂质增多，引起黄酮提取率下降［7，19］。所以，确定60%为合适的乙醇体积分数。

2.2 响应面分析法结果分析

在单因素试验的基础上，选取液料比(X1) 、超声时间(X2) 、超声温度(X3) 及乙醇体积分数(X4) 4 个因素为变量，以五叶草莓黄酮提取率为响应值，采用Box-Behnken中心组合设计进行了四因素三水平试验(表1) ，试验结果及方差分析结果分别见表2 和表3。

表2 Box-Behnken 试验设计及结果

表3 Box-Behnken 试验方差分析

采用Design Expert10 软件对表2 和表3 中的试验结果进行拟合分析，得到黄酮提取工艺参数回归模型，其回归方程为:

从表3 可知，黄酮提取工艺参数回归模型的P 值小于0.0001，达到极显著水平(P ＜0.01) ，且失拟项P 值=0.1618(＞0.05) ，不显著，决定系数R2=0.9748，表明无失拟因素存在，方程与试验拟合度较好，可用于五叶草莓黄酮提取的分析与预测。回归方程各项方差分析表明，4 个影响因素对五叶草莓黄酮类物质提取率影响的大小顺序依次为:液料比＞乙醇体积分数＞超声温度＞超声时间，且方程一次项(X1、X3、X4) 、二次项和交互项(X1X3) 的影响都是极显著的(P ＜0.01) ，一次项(X2) 和交互项(X1X2、X1X4、X2X3)的影响都是显著的(P ＜0.05) ，其余两项为不显著。

各因素两两交互作用对黄酮提取率影响的3D 响应曲面图如图6 所示。响应面坡度越陡峭且等高线越接近椭圆形，说明因素之间交互作用越明显，对五叶草莓黄酮提取的影响也越大，相反则表明因素间交互作用不明显，对五叶草莓黄酮提取率的影响较小［20-21］。

从图6 可知，液料比和超声温度两因素之间的响应面坡度最陡，交互作用极显著;液料比和超声温度、液料比和乙醇体积分数、超声时间和超声温度等两因素之间的响应面坡度陡峭且等高线趋于椭圆形，交互作用显著;超声温度和乙醇体积分数两因素之间响应面坡度比较平坦，交互不显著。上述结果与回归方程方差分析结果一致。

根据回归模型最优组合分析，优化的提取工艺参数为:液料比12 ∶1(mL/g) 、超声时间27 min、超声温度59 ℃、乙醇体积分数61%，其五叶草莓总黄酮提取率预测值为10.80 mg/g。以上述最优工艺组合进行五叶草莓黄酮提取，实际测得的黄酮提取率为10.68 mg/g，与模型理论预测值(10.80 mg/g) 之间的相对误差仅为1.12%，说明采用二次通用旋转组合设计优化得到的五叶草莓黄酮提取工艺参数准确可靠，可用于实际生产。