淫羊藿苷及宝藿苷I对气管切开模型大鼠肺组织病理学及炎症因子的影响

鞠静，彭玲玲，潘宇政*，谭人千，潘茂华，韦进新

(1. 广西医科大学第一附属医院, 南宁 530021； 2. 广西上林县人民医院，南宁 530500；3. 南宁市第四人民医院，南宁 530021)

气管切开术是临床抢救呼吸困难、病情危重病人采取的必要手段。但术后极易导致肺部炎症[1-2]。有效的预防及治疗气管切开术后肺部感染是临床急需解决的难题。目前抗生素治疗是针对肺部炎症的首选方案，但长期使用抗生素引起的不良反应和耐药性，使医药界致力于寻求更合理的替代治疗方案，从而减少抗生素的使用。

本课题组既往研究发现[3]，给予气管切开插管留置大鼠补肾阳中药淫羊藿水提取物后，对大鼠肺部感染有一定的疗效，免疫功能有所提高。目前研究认为，中药淫羊藿发挥作用的主要活性成分是以淫羊藿苷为代表的黄酮苷类化合物及其体内代谢产物[4]。现代药理学研究证明淫羊藿苷具有抗肿瘤、增强免疫、改善心脑血管、调节内分泌等多重药理学作用[5-7]，是近年来国内外学者研究的热点中药单体成分之一。随着淫羊藿苷的药理作用研究的不断深入临床上疗效也显示出巨大的优势。

本实验通过建立气管切开大鼠动物模型,探讨淫羊藿苷及其代谢产物宝藿苷I对气管切开术后大鼠肺组织损伤的作用并研究其可能的炎症反应机制，为中药指导治疗临床危急重症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6周龄SPF级雄性SD大鼠72只，体重(250 ± 20)g，购于广西医科大学实验动物中心【SCXK (桂) 2014-0002】。分笼饲养在环境温度为(20 ± 2)℃，相对湿度40%～60%的广西医科大学实验动物中心SPF级动物房【SYXK (桂) 2014-0002】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。自由进水，普通饲料喂养。所有的实验过程均经广西医科大学实验动物管理伦理委员会批准进行【伦理审批号：2014-KY-148】。

1.1.2 实验用主要试剂

淫羊藿苷(购于上海源叶生物科技有限公司，批号：T09N6B5664，HPLC≥98%)，宝藿苷I(购于上海源叶生物科技有限公司，批号：R11M8F 31212，HPLC≥98%)，大鼠IL-6 ELISA试剂盒(Cusabio，批号：S03019750)，大鼠TNF-αELISA试剂盒(Cusabio，批号：S14019751)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

将72只雄性SD大鼠进行1周的适应性喂养，随机分成4组(n=18)：正常组(A)、模型非用药组(B)、模型+宝藿苷I组(C)、模型+淫羊藿苷组(D)。

1.2.2 模型制作

大鼠实验前禁食12 h，自由饮水。B、C、D三组大鼠造模方法参照经典文献[8]实验性气管切开肺部感染模型进行。如1导管内有呼吸所致蒸气贴壁；2将刀柄置于外口，刀柄上出现气雾；3将棉花或者发丝置于两组导管外口，可见其随呼吸飘动。证实导管在气管内；术后大鼠清醒视作动物模型制作成功。

1.2.3 给药干预

模型制作成功后 6 h 进行给药干预。C 组给予宝藿苷I 4 mg/(kg·d)、D 组给予淫羊藿苷 30 mg/(kg·d)灌胃，实验用药均参照《药理实验方法学》[9]按人和大鼠体重换算得出，A、B 组给予等量0.9% 生理盐水，每日1 次。大鼠处理24、72、168 h后，各组分别取材6只大鼠。用戊巴比妥钠溶液45 mg/kg腹腔注射麻醉后，剖开胸腔, 用止血钳夹闭右主支气管，用4℃预冷灭菌0.9% 生理盐水3 mL反复灌洗左肺部3次，共回收肺泡灌洗液约6 mL(用于测定TNF-α及IL-6含量)。剪取右肺组织放入4%多聚甲醛溶液固定(HE染色观察组织病理学)。

1.3 主要观察指标

1.3.1 肺组织苏木精-伊红染色

取左肺组织用冰冻生理盐水清洗后，放入4%多聚甲醛溶液固定12 h，常规脱水处理石蜡包埋，切片制成5 μm切片，经脱蜡按照苏木精-伊红染色步骤染色后于光学显微镜(Olympus，日本)下观察肺组织的病理形态学改变。并参考李丽玮等[10]改良版肺组织病理评分标准，进行肺组织病理评分。

1.3.2 肺泡灌洗液TNF-α及IL-6检测

将收集的肺泡灌洗液离心取上清严格按照ELISA试剂盒说明书操作，并使用酶标仪(Thermo Multiskan，美国)于450 nm检测吸光度值，根据标准曲线用专业软件CurveExpert 分别计算每个样本中TNF-α、IL-6的质量浓度。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠气管切开模型成功后的表现

术后大鼠清醒，一般活动情况、精神状态良好，偶见有大鼠出现痰鸣的症状。8 h后逐渐恢复饮水，随后慢慢开始少量自主进食。

2.2 肺组织病理评分

B组大鼠气管切开插管留置后三个时段肺组织病理评分均明显高于A组正常大鼠，差异有显著性(P=0.011、0.011、0.009)，且随着时间延长，B组内逐渐升高。C、D两组分别用宝藿苷I和淫羊藿苷处理后，与B组相比：C组在168 h(5.833 ± 1.184)明显低于B组(10.750 ± 2.217)，差异有显著性(P=0.036)，D组在72 h(5.750 ± 1.258)、168 h(3.260 ± 0.527)均明显低于B组(9.680 ± 1.044、10.750 ± 2.217)，差异有显著性(P=0.009、0.013)。D组在24 h(5.500 ± 1.049)、168 h(3.260 ± 0.527)均明显低于C组(8.460 ± 1.361、5.833 ± 1.184)，差异有显著性(P=0.013、0.005)。C、D两组组内各时段相比，均在168 h明显低于24 h，差异有显著性(P=0.027、0.006)。这些结果提示：宝藿苷I和淫羊藿苷均可改善肺组织损伤程度，且淫羊藿苷效果更佳。结果见图1。

注：组间与A组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。与B组比较，#P< 0.05，##P< 0.01。与C组比较，△P< 0.05，△△P< 0.01。组内与24 h比较，□P< 0.05，□□P< 0.01。与72 h比较，P< 0.05，P< 0.01.(下图同)图1 大鼠肺组织病理学评分Note.*P< 0.05,**P< 0.01, vs group A.#P< 0.05, ##P< 0.01, vs group B.△P< 0.05,△△P< 0.01, vs group C.□P< 0.05,□□P< 0.01, vs 24 h.P < 0.05，P < 0.01, vs 72 h.(The same in the following figures)Figure 1 Histopathological scores of lung tissues in the rats

2.3 各组大鼠肺组织病理变化

如图2所示，A组正常大鼠：肺泡大小均匀，结构完整，肺泡上皮细胞形态正常，肺泡间隔未见增宽，微血管未见充血和淤血，肺间质间隙未见出血、水肿及炎细胞浸润。B组气管切开模型大鼠：肺泡间隔明显增宽，肺泡壁损伤、断裂，肺泡融合，微血管扩张、充血，部分肺泡腔内可见大量红细胞及炎症细胞，间质间隙充满中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，且肺间隔明显增厚，支气管管腔及周围炎性细胞浸润。随着时间延长肺组织损伤程度逐渐加重。C组宝藿苷I干预气管切开模型大鼠：肺组织损伤程度较B组轻，随着时间延长，肺泡结构逐渐完整，间隔变窄，肺泡腔及支气管周围炎性细胞逐渐减少。D组淫羊藿苷干预气管切开模型大鼠：损伤程度轻于B、C组，随着时间延长，肺组织结构越趋于正常组水平。

图2 各组大鼠肺组织病理变化(HE染色, ×100)Figure 2 Pathological changes of lung tissues in the rats of each group (HE staining, × 100)

2.4 各组大鼠各时点肺泡灌洗液IL-6、TNF-α含量

如图3、4所示，B组大鼠气管切开插管后肺泡灌洗液IL-6和TNF-α含量在三个时段均明显高于A组且差异有显著性(P=0.003、0.000、0.003；0.004、0.017、0.006)。C、D两组分别用宝藿苷I和淫羊藿苷干预后， IL-6、TNF-α含量在72、168 h均明显低于B组，差异有显著性(P< 0.05)；且C、D组组内IL-6和TNF-α含量在72、168 h均明显低于24 h，差异有显著性(P< 0.05)；D组与C组相比，IL-6含量差异无显著性(P> 0.05)。D组TNF-α在72、168 h均明显低于C组，差异有显著性(P< 0.05)。这些结果提示：宝藿苷I和淫羊藿苷均可抑制气管切开插管大鼠肺泡灌洗液IL-6、TNF-α表达，且淫羊藿苷效果更佳。

图3 大鼠肺泡灌洗液中IL-6含量Figure 3 IL-6 content in the rat alveolar lavage fluid

图4 大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量Figure 4 TNF-α content in the rat alveolar lavage fluids

3 讨论

气管切开术，中医理论认为，其属于“金破不鸣”，肺主宣发肃降，肾主纳气，肺肾二脏功能正常，从而保证体内外气体的正常交换，“补肺益肾法”在肺系疾病的运用中较为常见，且疗效显著[11]。Wang等[12]研究的补肾益气方(主要由淫羊藿组成)，能减少COPD患者急性加重次数，改善肺功能，提高机体抗炎能力，重塑致炎/抑炎调控机制的平衡。Qiao 等[13]用淫羊藿苷干预小鼠哮喘模型，结果降低了小鼠气道高反应同时减轻气道炎症程度。本课题组前期实验发现淫羊藿水提取物对气管切开大鼠免疫功能有改善的作用[3]。本实验在动物气管切开实验模型基础上，研究淫羊藿苷及其代谢产物宝藿苷I对气管切开后早期肺部炎症的影响，以期获得改善气管切开后早期肺部炎症的有效中药单体。

IL-6是一种由淋巴细胞、中性粒细胞、单核巨噬细胞等多种细胞分泌的细胞因子，具有多种生物学功能，大量研究表明细胞炎性因子IL-6能够作为炎症早期因子，促进其他炎性因子的分泌，放大炎性反应[14]；TNF-α是由单核巨噬细胞分泌的具有防御和致病双重作用的细胞因子，在机体正常状态下水平较低，而在机体处于炎性状态时明显升高[15]， TNF-α 可通过增强中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的功能，刺激其产生超氧化物，释放溶酶体酶，介导其他炎症因子和细胞因子表达，进一步加重炎性反应，促进成纤维细胞增殖，诱导纤维母细胞分泌大量胶原蛋白，促进肺纤维化的发展[16]。洪原城等[17]临床研究发现急性肺损伤患者IL-6、TNF-α水平均显著高于对照组，且随着损伤程度的家中呈升高趋势，同时对患者预后分析显示，死亡组患者IL-6、TNF-α水平与存活组比较，差异均有统计学意义，结果提示IL-6和TNF-α水平可作为评价病情进展及预后的可靠指标。本实验研究结果显示，经气管切开插管造模后，大鼠肺泡灌洗液IL-6、TNF-α含量明显升高，三个时间段均明显高于正常组水平(P< 0.05)，且随着时间延长逐渐升高。这与魏珍星等[18]临床研究发现耳鼻喉术后患者并发肺部感染，炎症因子在体内进行性升高趋势一致。用宝藿苷I和淫羊藿苷干预后，IL-6、TNF-α含量在72、168 h明显低于模型对照组水平(P< 0.05)；且药物干预组组内IL-6和TNF-α含量在72、168 h明显低于24 h(P< 0.05)；两种药物干预比较，IL-6含量无明显统计学差异(P> 0.05)，但淫羊藿苷组TNF-α在168 h明显低于宝藿苷I(P< 0.05)。同时，肺组织病理结果提示，宝藿苷I组在168 h肺损伤程度明显轻于模型组，淫羊藿苷组在24、168 h肺损伤程度均明显轻于模型组及宝藿苷I组。

到目前为止，淫羊藿中已被分离鉴定的单体化合物有260余种，主要为黄酮类化合物，其中以淫羊藿苷含量最高[19]。淫羊藿苷又可经肠道菌群代谢为宝藿苷I、淫羊藿素等。刘蕊等[20]对淫羊藿苷在体内的代谢产物研究发现，淫羊藿素在调节脂肪肝过程中发挥主要作用。本实验研究发现淫羊藿苷改善气管切开大鼠肺部炎症及组织损伤程度优于宝藿苷I。其机制可能与二者药代动力学特性不同[21]有关，亦可能是淫羊藿苷经代谢后除宝藿苷I之外的代谢产物发挥主要作用。有关淫羊藿苷对气管切开后肺部炎症发挥药理作用的具体有效成分及机制，有待进一步研究。

综上所述，本研究通过建立大鼠气管切开术模型，证实淫羊藿苷及其代谢产物宝藿苷I对气管切开术后早期肺部炎症有一定疗效，且淫羊藿苷疗效优于宝藿苷I。其机制与抑制肺泡灌洗液炎症因子IL-6、TNF-α的表达，同时减轻肺组织损伤有关。为中药指导治疗气管切开术后肺部炎症提供有力实验依据。