蟛蜞菊内酯对对乙酰氨基酚致小鼠急性肝损伤的保护作用

孙小茗，左晓彬，王春宇，柏兆方, 安丽萍，李瑞生*

(1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013；2. 解放军总医院第五医学中心，北京 100039；3. 承德医学院 河北 承德 067000；4. 锦州医科大学 锦州 121001)

肝病是我国常见的疾病之一。在全世界的发病率也呈逐年上升的趋势。各种因素导致的肝损伤在肝病的发生与发展中起着重要的作用。急性肝损伤是肝病发生、发展甚至到恶化的基本途径，如果不及时治疗，甚至引发肝硬化、肝癌[1]。对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是临床上应用频率较高的解热镇痛药，过量的摄入会导致肝损伤[2]，从而影响细胞的增殖、分化与凋亡[3-5]。

蟛蜞菊内酯(wedelolactone)属于香豆草醚类化合物[6-7]，其主要成分提取于墨旱莲和蟛蜞菊等植物[6-7]。蟛蜞菊是菊科植物蟛蜞菊的全草，主要分布在我国的海南、广东、福建以及贵州等地，具有凉血散瘀和清热解毒的功效，在南美洲地区也将其用于肝疾病、脓毒性休克以及毒蛇咬伤等疾病[7-9]。实验已经证明了蟛蜞菊内酯可以抑制LPS所致的RAW264.7细胞IL-6、TNF-α炎性细胞因子的生成[10]，并对抑制肝纤维化具有较好的保护作用[11]。

在蟛蜞菊内酯的实际应用过程中发现，其在体内作用时，受到影响的因素较多，实验结果与体外实验存在一定的偏差，因此为了进一步观察蟛蜞菊内酯的保肝活性，本文对其进行了研究。在本次试验中采用的模型是乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤，通过试验中形态学观察、生化指标、ELISA反应等证明蟛蜞菊内酯对对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤的保护作用，为蟛蜞菊内酯临床应用提供可靠的理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康SPF级BALB/c小鼠32只，体质量(20.1±1.8)g，雄性，6～8周龄，所有小鼠均采购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2017-0006]。饲养于解放军总医院第五医学中心[SYXK(军)2017-010]，适应性饲养1周后，随机分为4组用于实验。12 h明暗交替照明，自由饮水进食。动物伦理审批号：LACUC-2017-013，按照实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂与仪器

蟛蜞菊内酯购于成都普菲德生物技术有限公司，批号18032201。APAP购自MCE(HY-66005)。谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(reduced glutathione assay kit,GSH)、谷胱甘肽-过氧化物酶(cellular glutathione peroxidase assay kit,GSH-PX)，试验中应用的测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。丙二醛(micro malondialdehyde assay kit,MDA)、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

所用仪器为SynergyH2型全功能微孔板检测仪，生产厂家为美国Bio-Tek公司；Nikon E200型光学显微镜及Mini-6 K微型离心机，生产厂家为杭州奥盛仪器有限公司；PL602-L型电子天平，生产厂家为梅特勒-托利多仪器有限公司；HC-3018R型高速冷冻离心机，生产厂家为安徽中科中佳科学仪器有限公司；KPJ-1 A型生物组织摊片烤片机，生产厂家为天津天利航空有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 药物配制

称取蟛蜞菊内酯，加生理盐水混悬至所需浓度(10 mg/kg；20 mg/kg)；称取对乙酰氨基酚溶于生理盐水至所需浓度(200 mg/kg)。

1.3.2 动物分组及处理

接受实验对象为健康BALB/c小鼠，在其饲养7 d后，将其分为对照组、模型组(APAP)、蟛蜞菊内酯低剂量组(10 mg/kg，APAP+Wed)、蟛蜞菊内酯高剂量组(20 mg/kg，APAP+Wed),每组8只，各组以灌胃的方式给药，对照组和模型组给与等量生理盐水，蟛蜞菊内酯低、高剂量组每天给药1次，连续给药7 d。给药第6天，模型组与蟛蜞菊内酯低、高剂量组小鼠腹腔注射溶解在生理盐水中的APAP(200 mg/kg)，对照组腹腔注射生理盐水，造模前12 h禁食不禁水，造模12 h后留取组织及血清样本，做各项测定用。收集的全血标本在室温凝结1 h后，4℃离心(3500 r/min，15 min)。

1.3.3 血清学指标检测

小鼠造模后禁食不禁水12 h，留取血清样本，静置1 h，3500 r/min，离心15 min取血清，冷藏4℃备用。按照试剂盒说明书的方法测定血清中ALT、AST、IL-6、TNF-α。

1.3.4 氧化应激指标检测

取冻存的肝组织，制备成10%组织匀浆，离心，取上清液，按照试剂盒说明书的方法检测肝组织中MDA含量和 GSH、SOD、GSH-PX活性。

1.3.5 肝组织病理学观察

取相同部位的肝组织固定于中性福尔马林固定液中，脱水石蜡包埋、切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，TUNEL染色，用于组织切片观察肝细胞的凋亡情况和肝病例损伤情况。

1.3.6 疗效观察及评价

观察蟛蜞菊内酯对小鼠AST、ALT的影响、对小鼠肝中SOD、MDA、GSH、GSH-PX的影响、对小鼠炎性反应的影响、肝细胞坏死以及肝细胞凋亡情况进行观察。炎性评价指标：通过小鼠血清IL-6、TNF-α水平进行评价，其水平越高代表其炎性反应越大；肝细胞坏死的评价标准：切片中出现无核肝细胞残体可评价为肝坏死；肝细胞凋亡的评价标准：当TUNEL染色呈阳性时代表 细胞出现凋亡，其切片特点为细胞核表现为棕褐色，凋亡小体则为较小的棕褐色圆形小体。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 对小鼠ALT、AST的影响

ALT，AST是肝损伤的主要酶标记物，当肝细胞受到损伤时，会导致二者血清浓度急剧升高。由表1可以看出，模型组小鼠血清中的AST和ALT水平与对照组对比明显较高，经统计学计算后显示(P<0.01)，说明其存在统计学意义；蟛蜞菊内酯各剂量组的AST和ALT水平明显要高于模型组，经统计学计算后发现(P<0.01)，统计学意义明显，结果显示蟛蜞菊内酯具有较好的保护肝受损的作用。见表1。

2.2 对小鼠肝中SOD、MDA、GSH、GSH-PX的影响各组小鼠SOD、MDA、GSH、GSH-PX活力

模型组的GSH和MDA水平明显高于对照组，且统计学计算后显示(P<0.01)，统计学意义明显；模型组的GSH-PX和SOD水平明显低于对照组，且统计学计算后显示(P<0.01)，统计学意义明显；蟛蜞菊内酯各剂量的肝组织MDA和GSH水平明显低于模型组，且SOD和GSH-PX水平高于模型组，组间数据差异均显示(P<0.01)，具有统计学意义。表2结果显示蟛蜞菊内酯具有一定的抗氧化作用。见表2。

2.3 对小鼠TNF-α、IL-6的影响

模型组的IL-6和TNF-α水平明显高于对照组，且统计学结果显示(P<0.01)，存在统计学意义；与模型组比较，蟛蜞菊内酯各剂量组明显降低小鼠血清中TNF-α、IL-6水平(P<0.01)，统计学意义明显。结果表明，蟛蜞菊内酯能够抑制炎性细胞分泌，减轻炎性反应，阻止损伤加重。见表3。

表1 蟛蜞菊内酯对小鼠ALT、AST的影响Table 1 Effect of wedelolactone on the levels of ALT and AST in liver tissues

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

Note. Compared with normal group,##P<0.01. Compared with model group,**P<0.01.

2.4 蟛蜞菊内酯对肝损伤小鼠肝病例改变的影响

按照以上实验方法，小鼠连续给药7 d后，各组对小鼠的肝实施组织病理学观察。结果显示，正常组小鼠肝小叶和肝细胞结构清晰，肝索呈放射状排列，且核居中。汇管区未见炎细胞浸润。肝损伤模型组可见肝小叶结构破坏，排列紊乱，肝血窦扩张充血中央静脉附近大面积肝细胞坏死，伴有肝细胞广泛性水肿和细胞炎性浸润。蟛蜞菊内酯各给药组肝病变程度较模型组有明显的改善，肝细胞变性和坏死面积明显减少，局部仍可见炎细胞浸润。结果提示，模型成功，蟛蜞菊内酯各给药组对缓解肝组织损伤均有一定的作用。见图1。

2.5 蟛蜞菊内酯对肝损伤小鼠凋亡改变的影响

对照组小鼠肝组织切片中未见到黄色细胞核，与对照组比较，模型组黄色细胞核明显，大量肝细胞凋亡；与模型组比较，蟛蜞菊内酯低剂量组和高剂量组棕褐色细胞核减少，肝细胞凋亡明显减少，且高剂量组明显优于低剂量组。结果进一步表明，蟛蜞菊内酯对APAP造成的肝细胞凋亡具有抑制作用且有一定的差异。见图2。

表2 蟛蜞菊内酯对肝组织中SOD、MDA、GSH、GSH-PX的影响Table 2 Effect of wedelolactone on hepatic levels of SOD, MDA, GSH, and GSH-PX

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

Note. Compared with normal group,##P<0.01. Compared with model group,**P<0.01.

表3 蟛蜞菊内酯对血清中TNF-α、IL-6的影响Table 3 Effect of wedelolactone on serum levels of TNF-α and IL-6 in the mice

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

Note. Compared with normal group,##P<0.01. Compared with model group,**P<0.01.

图1 蟛蜞菊内酯对纤维化小鼠肝组织病理学的影响(HE染色)Figure 1 Effect of wedelolactone on liver tissue pathology in the mice with liver fibrosis (HE staining)

图2 蟛蜞菊内酯对纤维化小鼠肝组织肝细胞凋亡的影响(TUNEL)Figure 2 Effect of wedelolactone on apoptosis in hepatocytes in the mice with liver fibrosis

3 讨论

肝是人体的重要脏器之一，具有解除毒物和药物的作用，同时也容易受到有害因素的影响，造成肝损伤。发生肝损伤之后，可通过的一定的方法进行恢复，例如在肝损伤早期，通过及时服用治疗药物可恢复肝细胞的正常功能，但是如果未能及时进行治疗，那么损伤的肝细胞则无法恢复至正常，并且会发展为肝硬化、肝纤维化甚至是肝癌。所以在肝损伤的治疗中，能够明确其发病机制以及药物治疗的作用，对肝病的治疗的具有重要意义。本研究通过建立对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤模型，研究蟛蜞菊内酯对对乙酰氨基酚小鼠的保护作用。

APAP诱导的急性肝损伤动物模型，其具有良好的稳定性，并且容易复制，造模时间短，因此其是抗肝纤维化和筛选保肝药物的较常用的动物模型[13-17]。APAP是应用最为广泛的非甾体类解热镇痛药，因此对乙酰氨基酚所导致的肝毒性已经成为了药物性肝损伤的主要原因[13-19]。APAP在体内的代谢方式主要是通过葡萄糖的硫酸化和醛酸化作用生成无毒的代谢物排出体外[13-20]。一小部分APAP是在细胞色素P450酶的作用下产生NAPQI，NAPQI是毒性中间体，其在肝内可以和GSH结合，达到解毒的效果[13-21]。但是当临床大剂量应用对乙酰氨基酚后，硫酸化通路和葡萄糖醛酸化的通路均达到饱和状态，对应的对乙酰氨基酚就会通过细胞色素P450酶转化成NAPQI，再次过程中会迅速的消耗肝细胞内的GSH[13-22]，当GSH被耗尽之后，NAPQI就会与肝细胞内的蛋白质结合，最后造成肝细胞的氧化损伤[13-23]。

在肝功能的评估中，常用的评价指标为AST和ALT，当肝细胞受损或者病变后，其细胞膜的通透性就会增加，导致AST和ALT的指标上升[24]。在本研究中模型组的ALT水平和和AST水平上升程度比较明显，并且经过组织学研究后发现，肝组织结构已经出现了明显的损坏，此研究结果表明，乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤模型复制成功。各剂量给药组均能显著降低ALT、AST，同时对乙酰氨基酚对于肝组织造成的损伤已经得到了一定程度的控制。结果显示，蟛蜞菊内酯可有效的预防并控制过量对乙酰氨基酚对肝组织造成的损伤，其对于肝细胞具有一定的保护作用。

MDA作为评价组织氧化损伤程度的生物标志物[25]，其水平的上升代表了组织氧化防御系统出现了损坏，同时也代表了组织氧化损伤出现了加强。在机体的抗氧化系统中，SOD是比较关键的酶，当其活性降低时，体内自由基的含量就会上升，导致脂质过氧化，细胞出现损伤[27]。在本次调查中显示，当给予小白鼠乙酰氨基酚后，其肝组织中的MDA水平出现了明显的上升，而SOD的活性则明显降低，这说明乙酰氨基酚已经对小白鼠的抗氧化防御系统造成了破坏，而肝组织也出现了明显的氧化损伤。

检测GSH和GSH-PX活性的高低，可以间接反映机体对氧自由基的清除能力。结果表明与模型组相比，蟛蜞菊内酯各给药组与GSH和GSH-PX活性均有显著性差异，说明蟛蜞菊内酯能提高机体对氧自由基的清除能力，从而减轻氧化应激所致的肝损伤的严重程度。

对乙酰氨基酚诱导的肝细胞坏死，可激活固有免疫细胞，而固有免疫细胞释放的炎性介质，如炎性因子，氧自由基等，参与肝损伤的进展。库普弗细胞定位于肝的具有噬菌作用的巨噬细胞，具有免疫调节作用。有文献表明，对乙酰氨基酚诱导的情况下，库普弗细胞激活产生的TNF-α表达量升高[28-29]，Masubuchi等[30]研究发现，IL-6基因敲除的小鼠肝细胞内的热休克蛋白缺乏，导致机体对对乙酰氨基酚肝毒性更加敏感。本实验结果表明小鼠血清中TNF-α水平明显升高，经过蟛蜞菊内酯治疗后，小鼠血清中TNF-α、IL-6明显降低。说明蟛蜞菊内酯可以抑制炎性细胞分泌TNF-α、IL-6，减轻炎性反应，阻止肝损伤加重。HE和TUNEL染色切片显示，与模型组比较，蟛蜞菊内酯组肝组织形态改善明显，说明蟛蜞菊内酯具有减轻炎性细胞浸润，抑制细胞凋亡的作用。

综上所述，蟛蜞菊内酯可以抑制对乙酰氨基酚对肝的损伤，提示蟛蜞菊内酯可能是一种具有明显保肝作用，极具开发价值的候选药物，作用可能与抑制对乙酰氨基酚对肝的氧化损伤有关。也为进一步探究机制提供了依据。