基于金银合金薄膜的高灵敏度宽光谱表面等离子体共振成像传感器

梁爽，高然，张萌颖，薛宁，祁志美,＊

1中国科学院电子学研究所，传感技术国家重点实验室，北京 100190

2中国科学院大学，北京 100190

1 引言

表面等离子体共振成像(surface plasmon resonance imaging，SPRI)是一种消逝波传感技术，主要用于对生化样品进行原位实时非标记探测。SPRI在几何光学上是一种棱镜全反射光束成像，只不过入射光束在消逝场作用下与设置于棱镜全反射面上的金、银等贵金属薄膜的表面等离激元(SPP)发生了共振耦合，使得反射光的强度、位相、或波长受到SPP的强烈调制，从而携带了关于薄膜表面的一些物理、化学信息，这些信息经图像记录和图像解析可以被获取和利用。SPRI不仅具有一定的二维空间分辨率，能够同步检测芯片表面不同位点的生化反应，而且具有较高的时间分辨率，能够实时跟踪不同位点的生化反应过程。自从 1987年Yeatman首次利用激光光源开展单色SPRI研究之后1，该技术在国际上引起了高度重视和广泛研究，现已获得商业化开发，并被应用于生物制药、生命科学等多个领域2-6。单波长SPRI装置通过在给定入射角下测量图像灰度的变化完成生化样品的检测，动态检测范围较窄，一次成像难以反映成像区域所有位点的生化反应。Knobloch等人7于1996年首次利用白光光源获得了SPR彩色图像。相比于SPR灰度像，SPR彩色图像包含波长信息，动态检测范围宽，原则上一次成像能够提供整个成像区域所有位点的生化反应信息8-10。但是，如何从共振彩像中提取出只与波长相关的参数？这一关键问题直到 2006年才被香港学者Ho等人突破11。在此之前，彩色SPRI也只是用于直观的图像分析，不能进行定量检测。Ho等人11将SPR彩像在HSV颜色空间12进行处理，得出共振彩像的色相(Hue)分布。色相只与决定图像颜色的波长有关，而SPR彩像的颜色取决于共振波长，因此彩色SPRI能够借助色相算法对待测物质进行定量检测。我国对SPR传感技术非常重视，研究单位较多，主要包括中国科学院电子学研究所和化学研究所，以及清华大学和深圳大学13-16。中国科学院化学研究所陈义课题组早在2007年就研制出了彩色SPRI装置，但他们未对仪器的定量检测功能进行开发和利用17,18。2017年本课题组将色相算法与宽光谱SPRI技术相结合，利用聚四氟乙烯涂覆的金膜传感芯片，实现了对水中强致癌性苯并芘分子的原位图像分析和定量检测19,20，实验验证了传感器基于二维色相分布的微观尺度局域定量探测本领。

金膜SPRI传感芯片化学稳定性好，但是检测成本较高，灵敏度有限，不足以探测分子量低于200 Da的生化小分子21,22。银膜SPRI传感器虽然灵敏度高，但化学稳定性差23。为了克服现有SPRI传感器的不足，本文成功研制出基于金银合金薄膜的宽光谱 SPRI传感器。金银合金薄膜稳定性好，场增强因子高，能够导致比金膜SPR传感芯片更高的检测灵敏度，有效降低检测成本24-26。本文通过对金银合金薄膜SPP共振波长和共振彩像进行同步测量，结合色相算法对共振彩像的处理，建立了共振彩像的色相值与共振波长的依赖关系，获得了共振彩像的色相对表界面生化反应最为敏感的光谱区域。在此基础上测试了金银合金薄膜SPR彩像的色相对液体折射率的灵敏度和对牛血清蛋白(BSA)分子吸附的动态响应，并与金膜SPRI传感器的折射率灵敏度进行了比较。

2 实验部分

2.1 金银合金薄膜SPR传感芯片的制备

用于制备SPR传感芯片的玻璃基底购自日本Matsunami Glass株式会社(厚度 0.9 mm，n =1.522@λ = 633 nm)，用于淀积金银合金薄膜的溅射靶购自北京翠铂林有色金属技术开发中心有限公司，溅射靶由质量比为1 : 1的金银合金制得。在制备SPR传感芯片时，首先用丙酮、乙醇、Milli-Q超纯水依次超声清洗玻璃基片，基片被烘干后放入射频溅射装置的腔室内，首先经历 3 min氧等离子体刻蚀以去除玻璃表面的吸附分子，然后在基片表面依次淀积3 nm铬和50 nm厚的金银合金薄膜，由此形成SPR传感芯片。

2.2 实验仪器的构建

设计制备了Kretschmann结构多功能平台，该平台能够同步测试SPR共振光谱与共振图像，其关键部件包括：LS-1型卤钨灯和 USB2000+光纤光谱仪购自美国 Ocean Optics公司，45°/45°/90°玻璃棱镜(n = 1.799@λ = 633 nm)定制于北京北东光电自动化开发公司，彩色CCD数字成像模块(XSXS192)购自深圳显盛仪器有限公司，测角转盘、光纤准直器和线性偏振片购自北京大恒光电技术公司，多模石英光纤来自浙江雷畴科技有限公司，用于注液的蠕动泵购自保定兰格恒流泵有限公司，样品槽及其夹具自制。

Kretschmann结构多功能平台如图1所示，玻璃棱镜固定于测角转盘上，SPR传感芯片的玻璃基底一侧与棱镜底面通过折射率匹配液紧密贴合，金银合金薄膜暴露于样品槽内。卤钨灯发出的光依次通过多模石英光纤，光纤准直器及线性偏振片后成为p偏振平行光束(发散角小于0.2°)。平行光束以角度θ从棱镜一斜面射入棱镜，并在SPR传感芯片的玻璃/金属界面上发生全反射，全反射导致的消逝场在金银合金薄膜表面激励 SPP，使得从棱镜另一斜面输出的反射光受到 SPP的调制。反射光束射入显微镜筒后被筒内设置的半透半反镜分为两束光，其中一束光被CCD成像模块接收进行SPP共振彩色图像探测，另一束光经透镜聚焦于光纤端面，由光纤输入至光谱仪进行SPP共振光谱探测。SPP共振光谱探测的目的是为了建立共振彩像的色相参数与共振波长之间的依赖关系。

2.3 实验方法

为了建立共振波长与共振彩像的平均色相之间的依赖关系，超纯水被注入样品槽内覆盖金银合金薄膜，将光谱仪积分时间设为50 ms，调节起始入射角θ，使得反射光度谱在580 nm附近出现SPP共振吸收谷，在此条件下采集反射光强度谱和SPP共振彩像。之后逐步手动调节入射角，每次调节使得共振波长红移5 nm左右，在每次调节入射角前完成光谱和共振彩像的采集。从测得的反射光强度谱中得出SPP共振波长，利用色相算法从测得的SPP共振彩像中求出平均色相，然后将同一入射角下获得的共振波长和平均色相组成数据对，建立两者的对应关系。在本工作中，每一幅共振图像的大小为300 × 300像素，对应的芯片面积约为0.5 mm2。

在折射率灵敏度测定实验中，配制了质量分数分别为 0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.5%和2%的氯化钠水溶液。利用阿贝折射仪测得各溶液的折射率分别为 1.3330、1.3333、1.3337、1.3341、1.3346、1.3355和1.3364。测试时首先将超纯水注入样品槽，调节入射角θ = 12°，对应的起始共振波长约为595 nm，完成SPP共振光谱和共振彩像采集后将样品槽中的超纯水更换为给定浓度的氯化钠水溶液，再次采集SPP共振光谱和共振彩像，由此得出各个 NaCl浓度对应的共振波长和图像色相，进而获得金银合金薄膜SPR传感器的共振波长和图像色相对液体折射率的灵敏度。

图1 宽光谱表面等离子体共振成像实验平台示意图Fig. 1 Schematic diagram of the laboratory-made spectral SPR imaging platform.

为了测试 SPRI传感器对蛋白质吸附的图像响应本领，利用超纯水配制了浓度为10 μmol·L-1的牛血清蛋白(BSA)溶液作为待测样品，在入射角θ = 12°的条件下采集完超纯水对应的共振光谱及共振彩像后，再将BSA溶液注入样品槽，以1 min的时间间隔陆续采集SPP共振光谱和共振彩像，30 min后结束测试。

3 结果与讨论

3.1 共振波长与平均色相的依赖关系

图2a显示了在不同入射角度下测得的10个反射光强度谱，这些光谱被进行了归一化处理。每一个光谱包含一个又深又窄的波谷，该波谷是由金银合金薄膜SPP的共振吸收导致的，谷底对应的波长就是SPP共振波长。10个共振波长从λR=578.9 nm逐渐增大至λR= 629.9 nm，变化量为51 nm，图 2b显示了实验记录的 10个 SPP共振彩像，每一个彩像对应于图2a中的一个光谱，可以看出共振彩像的颜色随着共振波长的移动而变化。图2b还给出了共振彩像经过色相算法处理得出的二维色相分布。每一个二维色相分布由300 ×300个色相值组成，也就是说共振彩像中的每一个像素点对应一个色相值，因此利用色相作为灵敏度参数，彩色SPRI传感器能够测量一个象素对应的局域灵敏度。求取这些色相值的平均值就获得了整个共振彩像的平均色相。图2c显示了共振彩像的平均色相与共振波长的依赖关系。从图中看出，平均色相值随着共振波长的红移呈非线性上升趋势；在594.9-610.2 nm波长区间色相变化最快，由126.1线性增大至241.2，斜率为Δhue/Δλ =7.52 nm-1。这一斜率意味着以色相作为灵敏度参数，彩色SPRI传感器的灵敏度比波长检测型SPR传感器高7.5倍。因此，将594.9-610.2 nm波长区间确定为色相敏感区间，可以使传感器具有较高的色相灵敏度。值得强调的是，只要金银合金薄膜SPR芯片参数给定，图2c所示的平均色相与共振波长的曲线关系不随芯片的更换而发生变化。该结论已经通过多次实验测试得到确认。

3.2 金银合金薄膜SPRI传感器的折射率灵敏度

图2 不同入射角度下测得的(a)共振光谱和(b)共振彩像以及共振彩像的二维色相分布；(c)共振彩像的平均色相值与共振波长的依赖关系Fig. 2 (a) Resonance spectra measured at different incident angles, (b) the corresponding resonance images and their 2D hue profiles; (c) relationship between the average hue and the resonance wavelength.

利用一系列浓度已知的 NaCl水溶液作为折射率液体，在入射角 θ = 12°下测试了 SPRI传感器的共振波长和共振彩像的色相参数对液体折射率的灵敏度。图3a所示的实验结果为不同浓度氯化钠溶液的SPP共振彩像及其对应的二维色相分布，图中显示，随着NaCl水溶液质量分数从0%逐渐增加到2%，SPP共振彩像的颜色及对应的二维色相分布逐渐发生变化。图3b显示了共振彩像的平均色相值与溶液折射率的依赖关系。从图中可以得到，随着氯化钠溶液折射率逐渐增加，SPP共振彩像的平均色相从126.45上升至231.78，二者呈良好的线性关系，拟合度R2= 0.993，直线斜率代表 SPRI传感器的色相参数对溶液折射率的灵敏度。该灵敏度为 Δhue/Δnc= 29879 RIU-1(Refractive Index Unit)。为了比较，在相同实验条件下测试了金膜 SPRI传感器的平均色相对溶液折射率的灵敏度。设定起始共振波长约为590 nm，测得的灵敏仅为Δhue/Δnc= 3658 RIU-1，比金银合金薄膜SPRI传感器的灵敏度低8倍多。

图3 (a)不同浓度NaCl水溶液覆盖金银合金薄膜后测得的共振彩像以及计算得到的各彩像的二维色相分布；(b)平均色相与NaCl溶液折射率的依赖关系Fig. 3 (a) Resonance color images and the corresponding 2D hue profiles (images obtained after covering the goldsilver alloy film with different concentrations of aqueous NaCl solutions); (b) relationship between average hue and refractive index of aqueous NaCl solution.

实验还测试了金银合金薄膜SPR芯片的共振波长对液体折射率的灵敏度，并与基于色相的折射率灵敏度作了比较。图4a给出了在入射角θ =12°下测得的金银合金薄膜SPR传感器对NaCl溶液折射率的光谱响应结果。从图中可知共振波谷随着溶液折射率的增大逐渐红移。如图4b所示，共振波长与溶液折射率呈良好的线性关系，斜率为ΔλR/Δn = 3897.6 nm·RIU-1。该斜率即为传感器对折射率的光谱灵敏度，它比实验测得的基于色相的折射率灵敏度低7.67倍。这一比值与上述在色相敏感的光谱区间得到的直线斜率 Δhue/ΔλR=7.52 nm-1基本一致。

图4 (a)不同浓度NaCl水溶液覆盖金银合金薄膜后测得的共振光谱，(b)共振波长与NaCl溶液折射率的依赖关系Fig. 4 (a) Resonance spectra measured after covering the gold-silver alloy film with different concentrations of aqueous NaCl solutions; (b) relationship between resonance wavelength and refractive index of aqueous NaCl solution.

为了分析金银合金 SPRI传感器在现有条件下是否具有单像素定量生化探测本领，图5a给了由超纯水更换为1% (w，质量分数)氯化钠溶液所导致的共振图像中每一个像素的色相变化量。从该三维图中可以看出几乎所有像素的色相值都增大了，整个图像(300 × 300 像素)的平均色相变化量为47.2。但是不同的像素，其色相变化量不同，变化量最小为1.03，最大为135.43，离散度较大。进一步研究发现单像素点的色相与溶液折射率不满足线性依赖关系，而且对于同一溶液折射率变化，单像素点的色相变化重复性较差，这就意味着在现有条件下，SPRI传感器不具备单像素定量生化探测能力。通过分析数个至数十个像素的平均色相随溶液折射率的变化，发现当像素点增大至6 × 6像素，其平均色相与溶液折射率呈较好的线性关系，如图5b所示。上述分析结果指出在现有实验条件下，金银合金薄膜 SPRI传感器能够对6 × 6像素点所对应的微观敏感区域进行定量生化探测。

图5 (a)由溶液折射率变化导致的共振图像中任意像素点的色相变化量，(b) 6 × 6像素点的平均色相随溶液折射率的线性变化关系Fig. 5 (a) A change of hue at each pixel in the resonant image caused by a change in the refractive index of the solution, (b) The relationship between the average hue for 6 × 6 pixels and the solution index of refraction.

3.3 金银合金薄膜SPRI传感器对蛋白质分子吸附的响应

利用BSA水溶液作为被测样品，验证了SPRI传感器对蛋白质分子非特异性吸附的定量检测本领。首先利用阿贝折射仪对所配制的10 μmol·L-1的BSA溶液的折射率进行了测定，结果表明在测量精度范围内溶液折射率与超纯水折射率相同，从而排除了在测试过程中溶液折射率对传感器响应的影响。图 6a给出了在入射角 θ = 12°下，10 μmol·L-1BSA水溶液在吸附过程中的SPP共振彩像及其对应的二维色相分布。相比于直接观测SPR彩像的颜色变化，通过色相算法计算得到的图像二维色相分布可以更直观的反映外界折射率的改变情况。图6b给出了SPP共振彩像的平均色相随蛋白质吸附时间的变化情况，吸附反应开始时，共振彩像的平均色相为128.45，随着BSA分子在传感芯片表面的吸附量逐渐增加，共振彩像的平均色相也在逐渐增加，当吸附进行20 min时平均色相不再随时间变化，其稳定值为211.73。从吸附开始至吸附停止，色相的变化量为 Δhue =83.28。考虑到BSA分子在芯片表面的吸附最多只能形成一个完整的单分子层(即表面覆盖度Γ = 1)，而在现有条件下 SPRI传感器的平均色相测量误差约为σ = 4，按照3σ准则，传感器能够测得的BSA最小表面覆盖度近似为0.14。

图6 (a)在BSA吸附过程中测得的共振彩像以及彩像的二维色相分布，(b)共振彩像的平均色相与吸附时间的依赖关系Fig. 6 (a) SPR images corresponding to different adsorption time and two-dimensional hue profiles corresponding to different SPR images; (b) average hue versus adsorption time.

4 结论

本文报道的一种基于彩色图像色相算法的宽光谱SPRI生化传感器，它使用金银合金薄膜制作SPR传感芯片，具有时间分辨的图像分析和微观区域定量检测本领。与传统的金膜SPRI传感器相比，金银合金薄膜 SPRI传感器具有检测灵敏度高、检测成本低的优点。通过实验测试，建立了金银合金薄膜SPP共振彩像的平均色相与SPP共振波长的依赖关系，确定了色相敏感的光谱区间为594.93-610.16 nm。实验获得了金银合金薄膜SPRI传感器的平均色相对液体折射率的灵敏度为29879 RIU-1，比基于共振波长的折射率灵敏度高7.5倍，并且显著高于传统的金膜SPRI传感器的平均色相对液体折射率的灵敏度。本文进一步实验验证了金银合金薄膜 SPRI传感器适用于对蛋白质分子吸附过程的原位动态检测，能够对表面覆盖度小于5%的BSA吸附分子作出明显响应。本文研究结果指出这种基于金银合金薄膜的宽光谱SPRI传感器在生化物质的原位非标记检测中具有良好的应用前景。