基于白色念珠菌体外抑菌效果的复方苦参洗剂抑菌作用评价

程洪杰，李岩*，孙铁峰

(1.山东省新泰市中医医院，山东 泰安 271200；2.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

白色念珠菌是一种机会致病真菌，临床上诱发的感染性疾病主要由机体正常菌群失调，导致其在机体内大量繁殖而引起。随着唑类、多烯类抗真菌药物的广泛应用，使耐药菌株产生率不断上升[1-2]。大量研究表明中国传统医学中的中药及复方制剂在抗真菌方面疗效确切、安全性好、耐药率低[3]，而目前对中药类制剂抗真菌研究主要集中在复方对真菌类疾病的临床疗效研究、复方中单味药及其提取成分对真菌抑菌活性和机理研究[4-7]。以复方协同增效的观点，对中医组方原则下的君、臣、佐、使进行评价的实验研究尚不多见。

本实验中复方苦参洗剂(鲁药制字Z09080016)由苦参、地肤子、黄柏等8味中药复方组成，是我院研制用于治疗念珠菌等真菌感染的中药复方制剂，临床上应用于治疗女性阴道炎、外阴瘙痒、湿疹和癣等疾病并取得良好疗效。该制剂体现了清热解毒、燥湿止痒的中医组方原则，文献表明方中各药味均具有一定的抑菌活性，按照中医原则组方后，其表现出复方抑菌效果的增强。但是否与方中君、臣、佐、使药组的协同增效有关，尚待进一步研究。本实验以临床主治的白色念珠菌为代表，通过体外对白色念珠菌的抑菌效果，以上述问题为导向，对该制剂的复方抑菌增效作用进行评价研究，为该制剂的复方抑菌增效机理提供理论支撑，也为制剂的工艺优化提供新思路。

1 材料

1.1 菌株与药材

菌株：由山东省临床检验中心提供，实验标准菌株为白色念珠菌(C.albicans, ATCC10231)。

中药材：黄柏Phellodendri Chinensis Cortex、蒲公英Taraxaci Herba、苦参Sophorae Flavescentis Radix、蛇床子Cnidii Fructus、地肤子Kochiae Fructus、花椒Zanthoxyli Fericarpium、白矾Alumen、白鲜皮Dictamni Cortex购自上海雷允上中药饮片厂，经山东省中医药研究院林慧彬研究员鉴定为真品，且与实验中复方苦参洗剂制剂中使用的中药材同批次，粉碎过100目筛备用。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

RPMI1640培养液(无抗生素型)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(Sabouraud Dextrose Agar，SDA)、沙氏葡萄糖肉汤培养基(Sabouraud Dextrose Broth，SDB)均购自上海一基实业有限公司；二甲亚砜(Solarbio公司)。

PBS缓冲液：称取Na2HPO42.9 g、KH2PO40.2 g、NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g，加无菌纯水至1000 mL，溶解，过滤除菌，4 ℃保存备用。

MTT染液：称取MTT(北京索莱宝科技有限公司)粉末0.5 g溶于100 mL PBS溶液中，避光搅拌溶解，过滤除菌，4 ℃保存备用。

1.2.2 仪器

CP114电子分析天平(上海奥豪斯仪器有限公司)； STIKCO2恒温培养箱(上海施都凯仪设备有限公司)；生物安全柜(苏净安泰超净工作台公司)；xMark酶标仪(美国BIO-RAD公司)；ZWY-211C恒温摇床振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；BXM-75VD立式高压蒸汽灭菌锅(上海博迅医疗生物仪器有限公司)；Allegra X-30R高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 供试药液的制备

单味药组水提液的制备：按照处方组成及复方制备方法，取苦参6.0 g、蒲公英6.0 g、黄柏3.0 g、地肤子3.0 g，白矾2.0 g、花椒2.0 g，蛇床子4.0 g、白鲜皮2.4 g分别单独置于250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL水，称定重量，回流提取3 h后补足重量，分取各单味中药续滤液20 mL用于后续实验，最终各单药组浓度相当于复方组中各生药浓度，分别为苦参0.060 g/mL、蒲公英0.060 g/mL、黄柏0.030 g/mL、地肤子0.030 g/mL、白矾0.020 g/mL、花椒0.020 g/mL、蛇床子0.040 g/mL、白鲜皮0.024 g/mL。121 ℃高压流通蒸汽灭菌25 min后置于4 ℃冰箱备用。

复方组水提液的制备：按处方组成全部药味一起提取，制备方法同上(批号20180706)，最终制得药液浓度相当于生药浓度为0.284 g/mL，取续滤液20 mL用于后续实验，121 ℃高压流通蒸汽灭菌25 min后置于4 ℃冰箱备用。

君药组水提液的制备：取处方中君药组成苦参6.0 g、黄柏3.0 g、花椒2.0 g、白矾2.0 g，制备及后续保存备用方法同上，最终制得药液浓度相当于生药浓度为0.130 g/mL。

臣药组水提液的制备：取处方中臣药组成蒲公英6.0 g、白鲜皮2.4 g，制备及后续保存备用方法同上，最终制得药液浓度相当于生药浓度为0.084 g/mL。

佐药组水提液的制备：取处方中佐药地肤子3.0 g、蛇床子4.0 g一起置于250 mL圆底烧瓶中，制备及后续保存备用方法同上，最终制得药液浓度相当于生药浓度为0.070 g/mL。

2.2 供试菌液的制备

(1)菌种活化：在无菌条件下用划线法将冷冻保存在沙氏斜面培养基的标准菌株接入SDA上，37 ℃培养48 h进行活化。

(2)供试菌液制备：将上述菌种用标准接种环挑选单株典型新鲜菌落接入已灭菌的SDB中，37 ℃条件下摇床培养24 h，取出纯化培养的菌种无菌低温离心(3000 r/min )3 min，弃去上清液，用0.9%无菌生理盐水洗脱菌落制成菌悬液，经牛鲍氏计数板计数法调整其菌含量为1×106～5×106cfu ·mL-1，接种时再用RPMI1640培养液稀释1000倍为1×103～5×103cfu ·mL-1备用。

2.3 体外抑菌实验

单味中药组：取96孔细菌培养板，自第1行的第1～8孔分别加100 μL RPMI1640培养液，每行第1孔加200 μL供试中药水提液，第2孔加100 μL供试中药水提液，混匀后，自第2孔吸取100 μL混合液加入第3孔混匀，依次向下一孔吸取、混匀，作倍比稀释，至第8孔混匀后，吸取100 μL弃去，吸取2.2项下备用菌液100 μL接种至对应的96孔细胞培养板的第1～8孔中混匀，即制得浓度为原提取液浓度1/2～1/256的系列含药培养液，第9孔为阴性对照(加入100 μL 稀释为原浓度1/2的RPMI1640培养液及100 μL备用菌液)，第10孔为空白对照(加入10 μL MTT、100 μL DMSO)。本实验8种中药，每种单药采用上述方法倍比稀释为8个浓度梯度，各做3行复孔，于37 ℃恒温箱培养48 h。

复方组：精密吸取1 mL药物原液，加入无菌试管，以同体积RPMI1640培养液稀释混匀，得到浓度为原液浓度1/2的药液，同样方法再操作2次得到浓度为原液浓度1/8的药液备用。取96孔细菌培养板，自第1行的第1～5孔分别加100 μL RPMI1640培养基，每行第1 孔加100 μL上述1/8浓度供试中药水提液，混匀。自第1孔吸取100 μL混合液加入第2孔，依次作倍比稀释，至第5孔混合后，吸取100 μL弃去，吸取2.2项下备用菌液100 μL接种至对应的96孔细菌培养板第1～5孔中混匀，即制得浓度为原提取液浓度1/32～1/512的系列含药培养液，第6孔为阴性对照，第7孔为空白对照，同时做3行复孔，于37 ℃恒温箱培养48 h。

君、臣、佐各药组：稀释处理方法同单味中药组，最终制得浓度为原提取液浓度1/2～1/256的系列含药培养液，第9孔为阴性对照，第10孔为空白对照，同时做3行复孔。吸取2.2项下备用菌液100 μL接种至对应的96孔细菌培养板第1～8孔中混匀，于37 ℃恒温箱培养48 h。

C′=C0×f，

其中，C′为每孔最终稀释浓度，C0为原药液浓度，f为稀释分数。

MTT法判定ρMIC终点：两组于培养结束前4 h，每孔加入10 μL MTT染液后，继续培养至结束，加入100 μL二甲亚砜于摇床震摇20 min，无菌低温离心(3000 r /min )10 min，转移显色上清液于另一孔板，并做好标记，使用酶标仪测吸光度A570 nm，并计算抑菌率，以抑菌率大于等于80%孔的药液浓度作为ρMIC判定终点，实验重复3 次，以3次相同的ρMIC终点为报告依据。

抑菌率 = (A阴性对照-A实验组) /(A阴性对照-A空白对照)×100%。

2.4 体外联合抑菌实验

采用联合抑菌指数(IFIC)判定两药联合的作用结果。协同作用：IFIC≤0. 5；相加作用：0. 52 。

IFIC=(A*/A′)+(B*/B′) ，

其中A*为联用时A药组ρMIC，A′为单用时A药组ρMIC，B*为联用时B药组ρMIC，B′为单用时B药组ρMIC。

3 结果

3.1 单药组和复方组对白色念珠菌的体外抑菌活性结果

8味中药水提液及复方苦参组对白色念珠菌的体外抑菌结果见表1。由结果可知8味中药的ρMIC范围为7.50 ～30.00 mg/mL，其中黄柏、苦参、花椒、白矾4味君药的ρMIC范围为5.00～7.50 mg/mL；君、臣、佐各药组的ρMIC范围为4.01 ～21.00 mg/mL；复方组的ρMIC为2.22 mg/mL。

表1 各药组对白色念珠菌的体外抑菌活性

3.2 体外联合抑菌实验结果

4味君药以及君、臣、佐3个药组间进行体外联合抑菌实验，结果见表2、3。通过4味君药联合抑菌IFIC发现：黄柏+苦参、黄柏+白矾、花椒+白矾3组的IFIC≤0.5，作用性质为协同抑菌作用；黄柏+花椒、苦参+花椒、苦参+白矾3组的0.5

表2 黄柏等4味君药联合体外抑菌作用性质

表3 君、臣、佐药组联合体外抑菌作用性质

4 讨论

复方苦参洗剂处方系由清代《疡科心得集》中苦参汤化裁而来，方中苦参、黄柏、明矾大苦大寒，具有清热燥湿，解毒疗疮，杀虫止痒之功，花椒性辛散、温通，亦具止痛、止痒之功，4味药苦寒燥湿为主，辛温制寒湿为辅，共为方中君药；蒲公英、白鲜皮苦寒之性稍逊，以祛风燥湿，消肿散结之力辅助君药，为方中臣药；蛇床子、地肤子寒中有温，温而制寒，以温阳利湿之功为方中佐药，8药相合共奏清热解毒、燥湿止痒之功。研究表明方中8味中药都有特定抑菌机制，其中苦参中苦参碱具有抑制白色念珠菌细胞膜成分麦角固醇合成的作用，抑制其大量繁殖；黄柏中小檗碱可致白色念珠菌分裂周期异常而出现遗传物质丢失；地肤子甲醇萃取液可降低病菌体内酶活性[8-9]；蛇床子醇提液能降低真菌Hsp60和Hsp90的表达，抑制其增殖；白鲜皮提取物可降低白色念珠菌的ALS3、HWP1等相关基因的表达，花椒中挥发油、蒲公英中绿原酸都可破坏细菌细胞膜，白矾溶液可渗入菌体使内部蛋白变性，而起到抑菌作用[10-13]。

本实验发现复方中8味中药水提液对白色念珠菌均有一定的抑菌效果，其中花椒、白矾、苦参、黄柏4味君药对白色念珠菌抑菌效果较好，君药组的抑菌活性强于各单药组、臣药组和佐药组，复方组的抑菌效果最好；通过4味君药进行体外联合抑菌实验发现黄柏+苦参、黄柏+白矾、花椒+白矾的联合抑菌作用性质为协同抑菌，黄柏+花椒、苦参+花椒、苦参+白矾的联合抑菌作用性质为相加抑菌；通过君、臣、佐3个药组间联合抑菌实验发现君药组+臣药组的联合抑菌作用性质为协同抑菌，君药组+佐药组、臣药组+佐药组的联合抑菌作用性质为相加抑菌。综上所述，复方组的联合抑菌效果明显强于单药组和君、臣、佐3个药组的抑菌效果，从4味君药联合抑菌结果分析，黄柏与苦参、白矾以及花椒与白矾的协同抑菌作用，苦参与花椒、白矾以及黄柏与花椒的相加抑菌作用都参与了君药组联合抑菌效果的增强，黄柏、苦参、花椒、白矾4味君药在复方整体的抑菌效果中作用较大，这体现了中医组方君药发挥主要治疗作用的原则。君、臣、佐各药组以抑菌效果由大到小排序为君药组、佐药组、臣药组，其中君药组+臣药组的协同抑菌作用体现了中医组方臣药辅助君药加强治疗作用的原则，而君药组+佐药组、臣药组+佐药组的相加抑菌作用体现了中医组方佐助药协助君、臣药加强治疗作用的原则。通过上述各药组协同和相加抑菌作用相互配合，使得复方苦参洗剂表现出更强的抑菌效果。

该中药复方在遣药组方时既遵循中医药理论原则，又符合现代多效、联合、协同的抑菌药物应用规律，本实验中复方苦参洗剂所含8味中药均具有不同的抑菌活性，通过对具有不同抑菌谱和抑菌机制的中药复方运用，提高了制剂的抑菌效果，作为传统制剂，还可根据本实验中复方抑菌协同增效作用的相关研究，优化黄柏、苦参、花椒、白矾4味君药的制备工艺，适当调整君药组、臣药组和佐药组的投料配比，使其更好地发挥中药抗菌作用。