两种精油熏蒸处理对双孢蘑菇贮藏特性的影响

李彦虎，贠建民，毕阳，牛耀星，刘小霞，王霆

(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州,730070)

双孢蘑菇(Agaricusbisporus)味道鲜美，富含蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质元素等，具有较高的营养价值。然而因其组织柔嫩，采后呼吸代谢旺盛、后熟以及蒸腾作用强烈，在采后贮藏中极易发生褐变、失水、开伞和腐烂等现象，极不耐贮藏，在常温下保质期仅为2～3 d[1-3]。因此，研究双孢蘑菇的采后保鲜技术，延长其贮运时间和货架期，具有重要的经济意义。

植物精油对多种细菌及真菌具有较好的抑制能力，并且能延缓果蔬采后品质劣变[4]，在果蔬保鲜中得到广泛应用。植物精油主要用于桃[5]、红提葡萄[6]、草莓[7]、枇杷[8]、酥梨[9]、柑橘[10]、猕猴桃[11]、生菜[12]等果蔬的保鲜，并有较好的保鲜效果。目前，植物精油在食用菌保鲜方面已有一些研究。据NASIRI等研究报道，苦皮藤精油结合黄芪胶涂膜处理可有效保持双孢蘑菇采后品质，抑制褐变和霉菌、酵母菌以及假单胞菌的繁殖，延长保质期[13]。另外，相较于以往双孢菇的浸渍或涂膜保鲜，植物精油具有较好挥发性，熏蒸处理可使其有效成分快速均匀地到达组织内部，在一定程度上增强了保鲜效果，GAO等[14]研究发现，用肉桂醛熏蒸处理双孢蘑菇，保鲜效果良好。

有关花椒精油、芥末精油在果蔬保鲜防腐方面已有报道。研究发现，花椒精油对红提葡萄致病菌青霉、黑根霉、黑曲霉具有较好的抑制效果[15]；芥末精油提取物异硫氰酸稀丙酯能有效降低草莓果实的腐烂率[16]，加之这2种精油挥发性成分含量高，抑菌效果好[17-18]，在农产品保鲜防腐中应用前景广阔。但花椒精油、芥末精油熏蒸应用于双孢蘑菇采后保鲜的研究尚未见报道。

本实验通过研究花椒精油、芥末精油熏蒸处理对双孢蘑菇贮藏过程中生理、生化及品质变化的影响，以期筛选出适用于双孢蘑菇保鲜的精油浓度，减缓双孢蘑菇采后品质劣变，为开发食用菌绿色保鲜剂、减少食用菌采后损失提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

双孢菇920，采于张掖市爱福农业发展股份有限公司，采摘后随即放入贮藏冷库，4 ℃预冷2 h后，挑选新鲜，色泽洁白，无虫害与机械损伤，大小均一，成熟度一致，菌伞直径3～4 cm的子实体为试材。

花椒精油、芥末精油：精油含量≥99%，上海源叶生物科技有限公司。

主要试剂：聚乙二醇6000 (PEG 6000)、交链聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、愈创木酚、邻苯二酚、三氯乙酸(TCA)，均为国产分析纯，天津光复精细化工研究所；硫代巴比妥酸(TBA)国产分析纯，南京化学试剂股份有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚(triton X-100)，纯度≥99.9%，上海瑞齐生物科技有限公司；牛血清蛋白生化试剂，上海源聚生物公司。

1.2 主要设备

UV756CRT紫外-可见分光光度计,上海佑科仪表有限公司；YX280B 不锈钢压力蒸汽灭菌器,上海三申医疗器械有限公司；722S 可见分光光度计,上海精密科学仪器有限公司；TGL-16 台式高速冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PHZ-98A 恒温振荡器,上海一恒科技有限公司

1.3 方法

1.3.1 熏蒸处理

将每组50个双孢蘑菇(2.2～2.4 kg)置于干净的聚乙烯(PE)塑料保鲜框内，容积约为5 L(10 cm×27 cm×22 cm)，框外侧底部粘贴直径9 cm平皿内置同样大小定性滤纸1张，作为简易精油挥发装置。按照每框蘑菇重量，设置不同精油处理量，在平皿内分别加入花椒精油和芥末精油，同时设定蒸馏水熏蒸处理作为对照，用PE保鲜膜将每个体系密封，置于(20±1)℃，RH 80%～90%条件下熏蒸处理4 h,然后将样品置于常温(25±1)℃条件下先进行花椒精油、芥末精油浓度的筛选，然后利用前期筛选的最佳浓度在低温(4±1)℃条件下进行后续实验。

1.3.2 精油筛选试验

按照每框蘑菇重量，设置0.1、0.5、1.5 mL/kg三个处理梯度，在常温(25±1)℃条件下开展精油筛选试验。每隔24 h取样，测定相关指标，每个浓度梯度设置3个重复。

1.3.3 感官指标

1.3.3.1 感官评价

参照孟德梅[19]方法并作修改：选择食品专业的10名学生经专业培训，对双孢蘑菇的色泽、组织形态、滋味气味等感官指标进行评价，评分低于60分则不能被消费者接受，评价标准详见表1。

表1 感官评价评分表Table 1 Sensory evaluation scale

1.3.3.2 褐变指数

参照张娜等[20]方法并做修改，按照子实体实际褐变情况评定褐变级数并计算褐变指数：0级-无褐变；1级-轻微褐变，但褐变面积小于1/10；2级-褐变面积为1/10～1/6；3级-褐变面积为1/6～1/4；4级-褐变面积为1/4～1/2；5级-褐变面积为1/2～3/4；6级-全部褐变。

(1)

1.3.3.3 腐烂指数

参照杨燕婷等[21]方法并做修改，按子实体实际腐烂面积评价其级数：0级-无腐烂；1级-轻微腐烂，但腐烂部分小于1/10；2级-腐烂部分为1/10～1/6；3级-腐烂部分为1/6～1/4；4级-腐烂部分为1/4～1/2；5级-腐烂部分为1/2～3/4；6级-全部腐烂。然后计算腐烂指数：

(2)

1.3.4 生理生化指标测定

(1)失重率测定：称重法[22]。

(2)褐变指数、腐烂指数测定：同1.3.3褐变指数、腐烂指数测定方法。

(3)呼吸强度测定：参照曹建康[22]的方法，采用静置草酸滴定法，单位为mg/(kg·h)。

(4)PPO、POD活性测定：取1 g样品加入2 mL提取缓冲液(内含1 mol/L PEG、4% PVPP和1% Triton X-100)和一定量4 ℃预冷过的石英砂于冰浴条件下研磨匀浆，然后于4 ℃、10 000g离心30 min，收集上清液即为粗酶液，4 ℃保存备用。PPO、POD活性测定均采用LIU等[23]的方法进行，单位为U/mg Pro，结果重复测定3次。

(5)丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的测定：取1.0 g样品加4 mL TCA溶液，冰浴条件下加4 ℃预冷的石英砂研磨匀浆后，于4 ℃、10 000×g离心20 min取上清液，4 ℃保藏备用。采用硫代巴比妥酸法测定[22]MDA含量，单位为μmol/g，结果重复测定3次。

(6)可溶性蛋白质含量测定：以牛血清蛋白测定标准曲线。取1.0 g样品加入2 mL生理盐水和一定量4 ℃预冷的石英砂，在冰浴条件下研磨匀浆，经4℃、10 000×g离心后，取上清液即为粗蛋白液，然后采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量，单位为mg/g，结果重复测定3次[24]。

1.3.5 菌落总数

采用棉拭取样法，于无菌条件下在双孢蘑菇子实体表面取3个约1 cm2大小的区域，将灭菌棉签用无菌水稍沾湿，在子实体每个选定区域揩抹多次，随后将棉签立即剪断，投入10 mL无菌生理盐水中振荡培养30 min(100 r/min、37 ℃)，制备10-1菌悬液，参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[25]测定子实体表面细菌总数，单位为CFU/cm2。

1.4 数据分析

采用Excel 2010统计数据，所有数据为3次重复试验所得，计算平均值和标准误差，并绘制图表；采用SPSS 18.0对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 常温精油筛选结果分析

2.1.1 两种精油对子实体感官品质的影响

不同处理的双孢蘑菇在常温条件下(25±1)℃下贮藏时感官评分均呈下降趋势，且各处理感官评分显著高于对照(P<0.05)。对照组在第4天时感官评分下降至63.33分(表2，表3)，表现为子实体明显开伞、褐变，菌盖发黏，并伴有明显异味；但经0.1 mL/kg花椒精油(表2)和1.5 mL/kg芥末精油(表5)处理后的子实体在第4天时感官评分仍为78.00、72.67，子实体开伞不明显、无异味产生，保鲜效果良好。由此可见，0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油处理能较好维持子实体感官品质。

表2 花椒精油最适保鲜浓度的筛选Table 2 Screening results of optimal concentration of Zanthoxylum essential oil

注：字母表示同一时间各处理间，在P<0.05水平差异显著性，下同。

表3 芥末精油最适保鲜浓度筛选结果Table 3 Screening results of optimal concentration of mustard essential oil

2.1.2 两种精油对子实体腐烂的影响

表2和表3结果表明，随着贮藏期延长，子实体逐渐发生腐烂变质。在第5天时，对照组腐烂指数达到42.11%，子实体表面发黏，出现大面积腐烂；但经0.1 mL/kg花椒精油和1.5 mL/kg芥末精油处理后的子实体腐烂指数仅为31.44%、36.89%，均显著低于同期对照组(P<0.05)，此时，部分子实体表面才开始发黏，菌柄处出现轻微腐烂。可见，0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油处理可有效减缓子实体腐烂。

2.1.3 两种精油对子实体褐变的影响

整个贮藏期内，子实体褐变程度逐渐加深，对照组褐变指数显著高于处理组(P<0.05)。贮藏后期，经0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油处理后的子实体在第5天褐变指数分别为22.14%、24.11%，子实体表面褐斑面积显著低于对照组(P<0.05)，由此可知，该质量浓度下，精油熏蒸处理能明显抑制子实体褐变(表2，表3)。

2.2 低温贮藏试验结果分析

2.2.1 两种精油熏蒸处理对子实体感官品质的影响

利用常温条件下筛选出的0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油进行后续实验。结果发现，双孢蘑菇在贮藏期内感官评分均呈下降趋势，对照与处理之间差异显著(P<0.05)，对照组在第10天时感官评分下降至53分(表6)，子实体出现开伞、褐变现象，但经0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油处理后的子实体在第10天时感官评分仍为75.35、71.33，子实体感官品质维持良好。

表4 两种精油熏蒸处理对双孢蘑菇感官品质的影响Table 4 Effect of two essential oils fumigation treatment on sensory quality of Agaricus bisporus

2.2.2 两种精油处理对失重率的影响

双孢蘑菇含水量高，干物质含量丰富，采后贮藏期间易通过呼吸作用消耗干物质、蒸腾作用失水导致质量减轻[26]。由图1-a可知，在整个贮藏期内，失重率呈现上升趋势，且对照组高于处理组，第8天以前各处理间失重率差异不大；第8天后，处理间逐渐出现较大差异，可见精油熏蒸处理能在一定程度上降低贮藏期间的失重率。

2.2.3 两种精油熏蒸处理对呼吸强度的影响

由图1-b可知，子实体呼吸强度在贮藏期呈现先升高后逐渐下降趋势，且对照组呼吸强度峰值在第2天出现，而处理组呼吸高峰则延后2 d出现；0.1 mL/kg花椒精油和1.5 mL/kg芥末精油处理的子实体呼吸强度峰值均低于对照组呼吸峰值，而0.1 mL/kg的花椒精油效果更显著(P<0.05)。可见，精油熏蒸处理可有效抑制双孢菇子实体呼吸作用。

a-失重率；b-呼吸强度图1 两种精油处理对双孢菇失重率和呼吸强度的影响Fig.1 Effect of two essential oils treatment on weight loss and respiratory intensity of Agaricus bisporus

2.2.4 两种精油熏蒸处理对褐变、腐烂指数的影响

褐变和腐烂是决定消费者选择双孢蘑菇的直接因素，它们既影响子实体外观，又对风味和营养物质有严重的损害[25]。由图2-a可知，贮藏期内，各处理子实体褐变指数逐渐升高，第4天后精油处理组与对照间差异逐渐变大(P<0.05)，精油处理组褐变指数上升趋势减缓，这是由于精油能抑制褐变[26]。且0.1 mL/kg花椒精油处理抑制褐变作用更明显，褐变指数第10天较对照组下降了31.7%。

图2 两种精油处理对双孢菇褐变指数、腐烂指数的影响Fig.2 Effect of two essential oils treatment on browning and rotting index of Agaricus bisporus

由图2-b可知，贮藏期内各处理的子实体腐烂指数逐渐升高，且处理组腐烂指数显著低于对照组(P<0.05)，尤其经0.1 mL/kg花椒精油处理后子实体腐烂指数均低于同期对照组，且与第10天对照组相比，腐烂指数下降了16%，可见精油处理能抑制子实体腐烂。

2.2.5 两种精油熏蒸处理对MDA含量的影响

MDA作为膜脂过氧化的中间产物，能降低膜脂的不饱和度而引起膜的通透性增加，从而造成细胞膜系统的损害[29]。因此，测量其在贮藏期内的动态变化具有重要的生物学意义。在双孢蘑菇贮藏期内，MDA含量呈现上升趋势，且对照组MDA含量显著高于同期处理组(P<0.05)。在第10天时，对照组MDA含量为1.50 μmol/g，而经0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油处理后的MDA含量分别为1.12 μmol/g和1.34 μmol/g(图3-a)，说明0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油熏蒸处理能抑制子实体中MDA的积累，维护了双孢蘑菇子实体细胞膜结构的稳定性。

2.2.6 两种精油熏蒸处理对可溶性蛋白含量的影响

如图3-b所示，整个贮藏期内，子实体可溶性蛋白含量变化呈现先缓慢下降后逐渐上升的趋势，总体含量变化维持在2.4～2.8 mg/g之间。贮藏前期，处理组可溶性蛋白含量低于对照组，而贮藏后期恰好相反，处理组与对照组之间可溶性蛋白含量变化差异较大。这可能是由于贮藏前期精油处理抑制子实体生理代谢活动，营养流失少，可溶性蛋白含量维持在较低的水平；贮藏后期，子实体品质逐渐劣变，细胞膜透性增加，导致细胞内可溶性蛋白外流，从而使后期可溶性蛋白含量呈轻微上升趋势。

a-丙二醛；b-可溶性蛋白含量图3 两种精油处理对丙二醛、可溶性蛋白含量的影响Fig.3 Effect of two essential oils treatment on MDA and soluble protein of Agaricus bisporus

2.2.7 两种精油熏蒸处理对多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性的影响

如图4-a所示，贮藏期内，无论对照还是处理组PPO均先逐渐上升，第8天后逐渐下降；但精油处理组PPO活性显著低于对照组(P<0.05)，说明0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油处理在一定程度上能抑制PPO活性；由图4-b可知，在贮藏期内子实体POD活性呈现“倒V型”变化趋势，即0～6 d，酶活性呈上升趋势，第6天时达到最高值，之后酶活性逐渐降低。在整个贮藏期内，对照组酶活性呈显著低于各处理组(P<0.05)，说明0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油处理能促进POD活性，延缓了组织衰老。

图4 两种精油处理双孢菇PPO、POD活性的影响Fig.4 Effect of two essential oils treatment on PPO and POD activities of Agaricus bisporus

2.2.8 两种精油熏蒸处理对菌落总数的影响

双孢蘑菇营养丰富，加之子实体表面缺乏保护组织，很容易造成采后微生物侵染，从而加速腐烂导致品质劣变[36]。由图5可知，贮藏期内各处理菌落总数呈上升趋势，且精油处理组显著低于同时期对照组(P<0.05)，第10天时对照组菌落总数为2.85×106CFU/cm2，而0.1 mL/kg花椒精油处理菌落总数为2.89×105CFU/cm2；1.5 mL/kg芥末精油处理菌落总数为2.91×105CFU/cm2。说明0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油均对子实体表面微生物有一定的抑制作用。

图5 两种精油处理对子实体菌落总数的影响Fig.5 Effect of two essential oils treatment on aerobic plate count of Agaricus bisporus

3 讨论

植物精油具有良好的抑菌及保鲜作用，是开发天然绿色保鲜剂的绝好材料[30]。本文研究了不同质量浓度梯度的花椒精油和芥末精油熏蒸处理对双孢蘑菇贮藏过程中生理、生化及品质变化的影响，结果表明：0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油熏蒸处理对双孢蘑菇采后贮藏期间感官品质、相关理化指标、呼吸强度、MDA含量以及PPO、POD活性等具有显著影响。

双孢蘑菇采后品质变化主要为失重和菇体组织变软，失重现象主要跟蒸腾作用失水和营养物质代谢相关[31]，而软化则由于子实体细胞壁降解所导致[32]。实验结果表明，0.1 mL/kg花椒精油和1.5 mL/kg的芥末精油处理均能显著降低贮藏期间的失重率，延缓组织变软，这可能是由于精油所含小分子物质如：甾醇、蒎烯、环氧化合物等，这些物质或是几丁质酶、β-1,3葡聚糖酶的抑制剂，从而使细胞壁免遭降解，维持子实体采后硬度和水分的散失。果蔬的呼吸作用导致营养物质消耗，呼吸代谢的强弱关乎果蔬贮藏性能[33]，因此，降低呼吸强度至关重要。本研究结果表明，0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油熏蒸处理能抑制子实体贮藏期内呼吸强度，减少营养物质消耗，推迟呼吸高峰出现，这一结果与陈丽娟等[1]在2 ℃下研究不同浓度乳酸钙溶液处理双孢蘑菇可推迟呼吸高峰到来的结果相似。

褐变是双孢蘑菇采后品质变化的又一表现，目前研究发现，引起双孢蘑菇贮藏期内褐变产生的主要因素有：微生物的侵染以及酶促作用[34]。本实验结果表明，贮藏期内褐变指数、MDA含量以及菌落总数均呈现上升趋势，且对照组与各处理之间差异显著(P<0.05)。贮藏过程中细胞膜脂过氧化产生MDA，从而破坏细胞膜结构，使膜透性增加，造成细胞内成分外流。一方面，引起多酚氧化酶与酚类底物的接触，造成酶促褐变，这也直接证明了多酚氧化酶活性在贮藏期内的变化趋势，即0～8 d，酶活性呈线性增加，而第8天后酶活性逐渐下降，这是由酚类底物减少所导致PPO活性下降[35]；另一方面，膜脂过氧化逐渐造成膜系统溃败，细胞内营养成分溢出子实体表面，势必导致微生物大量繁殖，加速褐变以及腐烂产生，这也间接的说明了整个贮藏期内腐烂指数逐渐升高的原因。通过0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油的使用在一定程度上抑制了PPO活性和微生物的繁殖，从而减缓贮藏期内子实体的褐变作用。

POD是一类比较复杂的酶，一方面在维持组织中活性氧代谢平衡过程中起重要作用[36]；另一方面在过氧化氢存在下也能催化酚类、类黄酮的氧化和聚合，从而导致组织褐变[37]。实验结果发现，0.1 mL/kg花椒精油、1.5 mL/kg芥末精油能促进POD活性，从而维护细胞免遭活性氧毒害，延缓组织衰老，但处理组POD活性升高，与子实体褐变呈正相关。

总之，植物精油作为一种新型绿色保鲜剂应用于食用菌保鲜具有一定的经济价值，然而，精油如何影响双孢蘑菇的采后生理生化品质，在理论上还缺乏系统的认识，其作用机理有待进一步深入探究。

4 结论

本文研究了常温(25±1)℃和低温(4±1)℃条件下花椒精油和芥末精油熏蒸处理对双孢蘑菇贮藏过程部分生理、生化指标及品质变化的影响。结果表明，在常温条件下，0.1 mL/kg花椒精油和1.5 mL/kg芥末精油熏蒸处理能较好维持双孢蘑菇子实体感官品质，能抑制子实体褐变、腐烂指数增加，可将双孢蘑菇常温货架期延长2 d；低温贮藏条件下，0.1 mL/kg花椒精油和1.5 mL/kg芥末精油熏蒸处理能维持双孢蘑菇感官品质，减缓褐变以及腐烂发生，抑制其子实体内PPO活性，降低表面细菌菌落总数，增强POD活性，延缓组织衰老进程；减缓失重率和呼吸强度，保持子实体内含水量和干物质含量，减缓贮藏期内品质劣变；抑制MDA的积累，降低了膜脂过氧化程度，保护了膜系统结构和功能的完整性，保障子实体的正常代谢机能，从而达到了保鲜效果。