壳寡糖与茶多酚复合保鲜剂对冷鲜牛肉的保鲜效果

高晓冉,刘程惠*,陈立国,苏晓燕,磨佳琳

1(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连，116600) 2(大商股份有限公司，辽宁 大连，116600)

冷鲜牛肉质地细嫩、味道鲜美、营养丰富，含有丰富的蛋白质、钾以及铁元素，尤其它的肉毒碱和肌氨酸含量更是远高于其他肉类，能够加速人体脂肪的新陈代谢、增强免疫力以及促进肌肉的形成，因此冷鲜牛肉已然成为当下国内外肉类市场的消费主流[1-2]。但是，冷鲜牛肉从原料检疫、屠宰、分割排酸，再到包装、运输、贮藏、销售的整个过程中会出现微生物污染、蛋白质氧化、色素降解和脂肪氧化等现象，从而导致其货架期短[3]。如何解决上述问题并延长冷鲜牛肉的贮藏期，一直是国内外的研究热点。

目前，常用的化学保鲜剂大部分都是人工合成的，使用不当会有一定的副作用，对人体健康存在潜在危害[4]。因此，作为代替化学保鲜剂的天然保鲜剂因其安全性高、抗氧化能力强、无毒副作用日益受到关注。应用于肉类的天然保鲜剂主要有：壳聚糖、壳寡糖、茶多酚、乳酸链球菌素、溶菌酶、天然香辛料提取物等[5-10]。其中，壳寡糖(chito-oligosaccharide) 是由壳聚糖经过降解而得的低分子聚合物，研究发现它的水溶性、抗氧化性及抑菌性均优于壳聚糖，同时它还具有保健的功能，容易被生物体吸收[11-13]。茶多酚有明显的抗菌、抗氧化作用，且安全无毒，是一种有推广价值的天然保鲜剂[14]。壳寡糖和茶多酚对肉类的抑菌和保鲜作用已有报道[15-17]。目前许多研究表明，天然保鲜剂复合使用比单一使用对肉类的抑菌和保鲜效果更好。复合使用将成为未来天然保鲜剂应用研究发展的趋势[18-19]。壳寡糖是近年来新开发的一种天然保鲜剂，目前关于壳寡糖与其他天然保鲜剂复配应用于冷鲜牛肉保鲜的研究还鲜少见报道。因此，为了进一步开发壳寡糖在冷鲜牛肉保鲜方面应用潜力，本研究将壳寡糖与不同浓度的茶多酚复配，研究其对冷鲜牛肉微生物生长、蛋白质和脂肪氧化程度、汁液流失率、硬度和颜色变化的影响，探寻壳寡糖与茶多酚在抑菌和保鲜效果的协同效应，以期为壳寡糖复合保鲜剂在冷鲜牛肉中的产业化应用提供参考以及科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷鲜牛霖，吉林省长春市皓月清真肉业股份有限公司；壳寡糖(分子质量<700)，西安泽邦生物科技有限公司；茶多酚(纯度≥98%)，合肥博美生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

VS-1300超净工作台，苏州市苏信净化设备厂；DNP-9162电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；UV-1600型紫外可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；SN-SQ立式压力蒸汽灭菌器，重庆雅马拓科技有限公司；Kjeltec-2300凯氏定氮仪，FcssAnalyticalAB公司；CR400/CR410色差计，日本KonicaMinolta公司；ZK600智能真空包装机，东莞市益健包装机械有限公司(真空极限：-0.1MPa)；真空包装袋，广东省东莞市广骏电器公司；TGL-20M医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；T-25匀浆机，德国IKA公司；DK-98-II型电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司，TA-XTPlus质构仪，英国StableMicroSystem公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

经排酸后的皓月牛霖，剔除筋膜后分割成约1 kg/块，随机分成5组，每组21块。对每组牛肉进行保鲜处理，添加去离子水的组为对照1，其余复合保鲜液添加量如表1。

表1 复合保鲜液添加量 单位：g/100mL

5组肉样分别在上述保鲜液中浸泡50 s后取出，摆放于灭菌的盘筛中，沥干，然后将其真空包装，于0～4 ℃的冷库中贮藏。分别在0、5、10、15、20、25、30 d测定各项微生物指标和理化指标。每个处理抽取3个样品重复测定，取平均值。

1.3.2 菌落总数和大肠菌群的测定

菌落总数按照GB/T 4789.2—2016测定[20]，结果以菌落总数的对数(lg CFU/g)表示。评价标准为：新鲜肉为104CFU/g以下，次鲜肉为104～106CFU/g，变质肉为106CFU/g以上[21]。

大肠菌群参照GB/T 4789.3—2016中的第二法平板计数法进行测定，结果以大肠菌群的对数(lg CFU/g)表示[22]。

1.3.3 色差的测定

用滤纸吸干冷鲜牛肉样品表面的水分，将其放于光源下，使用色差计测定肉样的L*(亮度)值和a*(红度)值，分别对每个样品的不同部位测定6次，取平均值。

1.3.4 肌红蛋白氧化状态测定

参考郭新颖的方法[23]，结果用高铁肌红蛋白(MetMb)百分含量表示。

1.3.5 脂肪氧化程度的测定(TBARS法)

参考郭新颖的方法[23]，数据结果用mg/kg表示。

1.3.6 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定

按照GB/T 5009.44—2003采用半微量定氮法测定冷鲜牛肉挥发性盐基氮的含量。评价标准如下：新鲜肉为15 mg/100g以下，冷鲜肉为20 mg/100g以下，变质肉为20 mg/100g以上[24]。

1.3.7 硬度的测定

将肉样切割成高约20 mm，底面积约40 mm×40 mm的方块状，采用TPA模式加载P-0.5探头进行质构测定(texture profileanalysis，TPA)，测试前、测试中及测试后速度均为1.0 mm/s，2次压缩距离均为10 mm，2次间停顿时间为2 s，通过分析力量-时间曲线，再根据参数定义及计算方法得到肉样的硬度[25]。

将肉样浸渍保鲜液沥干后对每块肉样进行称质量(m1)，并使用真空包袋分装。测试时拆开包装，用滤纸吸干样品表面的汁液，称量质量(m2)。

(1)

1.3.9 数据处理

试验均重复3次，结果用平均值±标准偏差表示。用Origin 8.0进行作图分析，SPSS 17.0统计软件进行显著分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉菌落总数和大肠菌群的影响

如图1所示，随着贮藏时间的延长，所有组冷鲜牛肉的菌落总数均逐渐增加(P<0.05)，但处理组的菌落总数均显著低于对照组1(P<0.05)。

图1 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉菌落总数的影响Fig.1 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on aerobic plate count of chilled beef

对照1的初始菌数为4.23 (lg CFU/g)，对照2的初始菌数为4.05 (lg CFU/g)，各处理组的初始菌落总数分别比对照1下降了7.52%、5.06%、10.85%。在第20天，对照1的菌落总数达到6.03 (lg CFU/g)，属于变质肉。第25天，对照2、处理1、处理2的菌落总数分别达到6.62、6.20、6.31 (lg CFU/g)，均属于变质肉。第30天，处理3的菌落总数为6.77 (lg CFU/g)，超过牛肉二级鲜度的标准。可见，单独使用壳寡糖对冷鲜牛肉有抑菌作用，但与茶多酚复配的抑菌效果更好，且处理3能有效抑制冷鲜牛肉中的微生物繁殖，并将菌落总数控制在25 d内不超标。

目前，国标对冷鲜牛肉中的大肠菌群数量还没有限量规定，但大肠菌群仍是评价食品质量安全的重要指标之一，其数值越大表明肉样受污染程度越大。由图2可知，随着贮藏时间的延长，所有组的大肠菌群数量均呈逐渐上升趋势。第0～10天，各组之间的大肠菌群数量变化差异不明显，从第15天之后，对照组1的大肠菌群数明显高于对照组2和处理组(P<0.05)。第30天，对照1的大肠菌群数为7.20 (lg CFU/g)，对照2的大肠菌群数达到6.89 (lg CFU/g)，而处理1、处理2和处理3的大肠菌群数比对照1分别减小了1.17、0.95、1.27 (lg CFU/g)，与对照2相比分别降低了0.85、0.63、0.95 (lg CFU/g)。可见，壳寡糖与茶多酚复配处理能够有效抑制大肠菌群数量上升，减缓冷鲜牛肉的受污染程度。

本研究中，0.06 g/100mL壳寡糖与0.3 g/100mL茶多酚复配处理对冷鲜牛肉微生物的抑菌作用明显优于单独使用壳寡糖处理，证明壳寡糖与茶多酚复合处理冷鲜牛肉可以产生良好的协同抑菌效应，这可能是因为壳寡糖与茶多酚的杀菌和抑菌作用所针对的优势菌不同，两者复合使杀菌和抑菌的作用范围扩大，并且壳寡糖能够增加细菌细胞膜的通透性，使更多的茶多酚通过细胞膜进入细菌内部，与遗传物质结合，阻断或延缓了细菌的生长和繁殖。

图2 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉大肠菌群的影响Fig.2 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on coliform of chilled beef

2.2 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉色差的影响

牛肉的色泽是消费者直观判断其新鲜程度的重要依据。L*值和a*值分别表示肉样的亮度和红度，L*值越大表明肉样颜色越深，a*值越大表明肉样颜色越红。由图3可知，各处理组与对照组冷鲜牛肉的L*值都随着贮藏时间的延长而减小，肉色稳定性不断降低，失色现象逐渐加重。对照1的L*值始终低于其他组，处理3的L*值在整个贮藏过程中最稳定。由图4可知，第0～5天，所有组冷鲜牛肉的a*值下降较快，之后下降速率减缓，从20 d开始对照1的a*显著低于对照2和各处理组(P<0.05)。

中国是一个以农业为主的国家，当前许多地区始终沿袭传统的农业生产模式，部分地区因为信息渠道不通畅，无法了解到市场的最新动态，农业生产技术也与市场发展的要求不一致，农业回报率始终处于较低的水平。伴随社会的不断前进，部分先进科技已运用到农业经济发展中，有效提升了农业经营效益，然而国内的农业生产模式依旧较为滞后。

图3 壳寡糖与茶多酚复配处理对牛肉L*值的影响Fig.3 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on L* of chilled beef

图4 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉a*值的影响Fig.4 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on a*of chilled beef

综合L*值、a*值的结果可见，壳寡糖与茶多酚复配可以延缓冷鲜牛肉的L*值和a*值下降，能有效防止色泽劣变。

2.3 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉高铁肌红蛋白(MetMb)含量的影响

冷鲜牛肉在贮藏过程中发生的颜色变化主要受肌红蛋白的影响，其在不同的氧化状态下呈现不同的颜色[26]。贮藏初期，冷鲜牛肉细胞中的肌红蛋白和氧气反应生成氧合肌红蛋白，使肉色呈鲜红色，但氧合肌红蛋白不稳定，随着贮藏时间的延长，进一步氧化为高铁肌红蛋白，肉色逐渐呈暗红色，高铁肌红蛋白积累到一定程度牛肉发生褐变[27]。

由图5可知，在0～5 d，各处理组与对照组冷鲜牛肉的MetMb %快速增加，之后增加速率均减小。整个贮藏期间，对照1组冷鲜牛肉的MetMb %始终显著高于其他组(P<0.05)；在5～30 d，各处理组的MetMb %含量开始低于对照2，但只有处理3的MetMb %含量显著低于对照2(P<0.05)。

图5 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉MetMb%的影响Fig.5 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on MetMb% of chilled beef

2.4 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉TBARS的影响

冷鲜牛肉在贮藏期间，其中的不饱和脂肪酸会发生酸败反应，生成丙二醛(MDA)，通过测定硫代巴比妥酸值能够评价脂肪氧化的程度[28]。由图6可知，在整个贮藏期间，对照1组冷鲜牛肉的TBARS值呈显著上升趋势(P<0.05)，其他组冷鲜牛肉的TBARS值在贮藏前15 d缓慢增加，从第20天开始显著增加(P<0.05)。从贮藏第10天，对照1组冷鲜牛肉的TBARS值显著高于其他组(P<0.05)。在第30天时，各处理组冷鲜牛肉的TBARS值分别比对照2组减少了0.25、0.16、0.29 mg/kg。

图6 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉TBARS值的影响Fig.6 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on TBARS of chilled beef

UTRERA等研究证实，牛肉蛋白质氧化产生的羰基和脂肪氧化产生的自由基能够与肌肉蛋白质褐色素中的自由氨基反应，从而加速褐色素物质的生成[29]。结合本研究中L*值、a*值的结果可以得出，冷鲜牛肉中肌红蛋白和脂肪的氧化程度与肉色稳定性成负相关。

2.5 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉TVB-N的影响

TVB-N值是反映鲜肉腐败程度的重要指标。TVB-N值越大表明肉的腐败程度越大。由图7可知，贮藏第0～5天，所有组冷鲜牛肉的TVB-N值基本没变化，第5天之后，对照组与各处理组的TVB-N值均开始增加，其中对照1组的TVB-N值快速上升，显著高于其他组(P<0.05)。贮藏20 d时，对照1组冷鲜牛肉的TVB-N值达到20.14 mg/100g，已变质；第30天时，对照2、处理1、处理2组的TVB-N值分别20.53、21.06、22.08 mg/100g，均已变质，而处理3组的TVB-N值达到19.07 mg/100g，未变质。可见，壳寡糖与茶多酚复合处理对抑制挥发性氨基氮的生成有很好的作用，并且0.06 g/100mL壳寡糖复配0.3 g/100mL茶多酚的抑制效果最佳。

图7 壳寡糖与茶多酚复配处理对牛肉TVB-N值的影响Fig.7 Effects of chitosano ligosaccharide and tea polyphenols on TVB-N of chilled beef

2.6 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉硬度的影响

由图8可知，在贮藏0～5 d，所有组冷鲜牛肉的硬度基本没有变化，从贮藏第10天，对照2和各处理组冷鲜牛肉的硬度均低于对照1，且处理3组的硬度显著低于对照1(P<0.05)，从贮藏第25天，处理3组的硬度显著低于对照2(P<0.05)。在贮藏第30 天，对照1的硬度达到18.15 N，对照2的硬度达到15.04 N，而处理1、处理2和处理3的硬度比对照1分别低4.78、3.55、5.70 N，比对照2分别低1.67、0.45、2.60 N。

图8 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉硬度的影响Fig.8 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on hardness of chilled beef

2.7 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉汁液流失率的影响

由于贮藏过程中冷鲜牛肉中的蛋白质胶体发生不可逆的水解，使得冷鲜牛肉的组织细胞结构变得极为松散，细胞内水分等物质不断向外扩散，造成汁液流失现象[30]。汁液流失率越大表明冷鲜牛肉的营养流失越多，肉质越差，新鲜程度越低。由图9可知，随着贮藏时间延长所有组冷鲜牛肉的汁液流失率逐渐快速增加。贮藏第0～20天，所有组冷鲜牛肉的汁液流失率无显著差异。第25天开始，对照1显著高于处理组(P<0.05)。贮藏第30天，对照1组冷鲜牛肉的汁液流失率增加到13.94%，而对照2、处理1、处理2、处理3组的汁液流失率分别比对照1组降低了1.23%、3.09%、3.06%、5.26%。可见，壳寡糖与茶多酚复配处理能够抑制冷鲜牛肉汁液流失，并且作用优于单独壳寡糖处理。

图9 壳寡糖与茶多酚复配处理对冷鲜牛肉汁液损失率的影响Fig.9 Effects of chitosan oligosaccharide and tea polyphenols on dripping loss of chilled beef

2.8 相关性分析

如表2所示，冷鲜牛肉在冷藏条件下微生物及各相关品质指标都发生了变化，通过pearson相关系数反应微生物指标与各品质指标的相关性。冷鲜牛肉贮藏期间菌落总数与大肠菌群呈极显著正相关(P<0.01)，表明它们会协同促进数量增长；微生物数量(包括菌落总数和大肠菌群)与L*值、a*值呈极显著负相关(P<0.01)，与MetMb %、TBARS、TVB-N、硬度、汁液流失率呈极显著正相关(P<0.01)，表明冷鲜牛肉贮藏过程中微生物数量的增加会加速牛肉颜色变暗变深，还会促进高铁肌红蛋白和挥发性氨基氮生成，加速脂肪氧化，破坏冷鲜牛肉的保水性，促使牛肉变硬。

表2 冷鲜牛肉腐败指标的相关性分析Table 2 Pearson correlation coef?cients of colorimetric value, microorganism content and anticorruption capacity

注：*-显著相关(P<0.05)；**-极显著相关(P<0.01)。

此外，L*值、a*值与MetMb %、TBARS、TVB-N呈极显著负相关(P<0.01)，进一步说明高铁肌红蛋白和挥发性氨基氮积累越多，脂肪氧化程度越高，冷鲜牛肉的色泽越差。

3 结论

在贮藏期内，壳寡糖与茶多酚复合处理对冷鲜牛肉的微生物总数、色泽(L*值、a*值)、MetMb %、脂肪氧化、蛋白质氧化、硬度、汁液损失率均产生有利影响。综合试验结果的理化指标和微生物指标判断，本研究中各处理组均能延长冷鲜牛肉的货架期，其中单独0.06 g/100mL壳寡糖组可将冷鲜牛肉保质期延长至20 d，0.06 g/100mL壳寡糖复配0.3 g/100mL茶多酚处理组对冷鲜牛肉的保鲜效果最好，可将冷鲜牛肉控制在25 d不变质，说明壳寡糖与茶多酚具有协同抑菌效应，对冷鲜牛肉的防腐保鲜具有良好的作用。