微生物发酵技术同步提取青钱柳多糖和黄酮

鲁青，严美婷，张超凤，张良

(江西省食品发酵研究所，江西 宜春，336000)

青钱柳是一种我国独有的、重点保护的珍稀树种，主要分布于江西、浙江等地[1-2]。研究表明，青钱柳含有多种有机活性物质，如多糖、黄酮及三萜类等[3]，具有降血糖血脂、抗肿瘤、抗氧化、保肝护肝等多种功效，其中多糖和黄酮是其主要的功效成分之一[4-9]。目前青钱柳多糖及黄酮的提取多采用热水浸提法、微波提取法和超声波提取法等[10-12]，但提取率不高，且提取工艺只对多糖和黄酮进行单独提取，易造成原料的浪费。而采用微生物发酵技术，利用微生物对青钱柳叶进行发酵，破坏柳叶的细胞壁，使细胞中的多糖及黄酮较大程度地同步溶出，即可达到同步高效提取多糖和黄酮的目的。

本研究采用微生物发酵技术对青钱柳多糖和黄酮进行同步提取，优化提取工艺，以得到一种经济有效、同步快速提取青钱柳多糖和黄酮的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青钱柳叶，采自江西修水县；纤维素酶(酶活力100 000 U/g)、半纤维素(酶活力50 000 U/g)，和氏璧生物科技有限公司；黑曲霉 CICC 2041、枯草芽孢杆菌 CICC 10023，由江西省食品发酵研究所微生物实验室提供；芦丁(99.8%)、葡萄糖(99.6%)，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；甲醇、石油醚、无水乙醇、苯酚、硫酸，西陇化工股份有限公司；AlCl3(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SP-756PC紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；ML204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，江苏金坛市亿通电子有限公司；QYC-2102摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司；LDZF-75KB高压灭菌锅、GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱，上海申安医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺

青钱柳叶干燥、粉碎→酶解→高温灭菌→接种→发酵提取→过滤→测定

↑ ↑

纤维素酶、半纤维素酶 黑曲霉、枯草芽孢杆菌

1.3.2 菌种活化

将黑曲霉接入马铃薯葡萄糖肉汤培养基中，在28 ℃、150 r/min 培养36 h制成黑曲霉种子液；将枯草芽孢杆菌接入营养肉汤培养基中，35 ℃、150 r/min培养18 h，制成枯草芽孢杆菌种子液。

1.3.3 青钱柳多糖和黄酮同步提取工艺优化

1.3.3.1 料液比的选择

称取适量青钱柳叶粉末，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL)添加水，然后加入0.4%纤维素-半纤维素酶(2∶1，m/m)复合酶，于55 ℃水浴加热酶解3 h后添加6%蔗糖，继而115 ℃灭菌20 min，冷却后以4%接种量接入菌种比为1∶3的黑曲霉与枯草芽孢杆菌混合种子液，于150 r/min、30 ℃发酵提取1.5 d。测定发酵液中多糖及黄酮提取率，以确定最佳料液比。

1.3.3.2 酶添加量的选择

在最佳料液比条件下，分别添加0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的复合酶酶解青钱柳叶，其他条件保持不变，发酵提取多糖和黄酮，测定发酵液中多糖及黄酮提取率，确定复合酶添加量。

1.3.3.3 菌种比例的选择

选择最佳料液比和酶添加量，其他条件不变，分别考察黑曲霉与枯草芽孢杆菌混合比为1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1对青钱柳叶发酵提取多糖和黄酮的影响，确定菌种比例。

1.3.3.4 接种量的选择

选择最佳料液比、酶添加量及菌种比例，分别以3%、4%、5%、6%、7%的接种量接入黑曲霉与枯草芽孢杆菌混合种子液，于150 r/min、30 ℃发酵提取1.5 d。测定发酵液中多糖及黄酮提取率，确定接种量。

1.3.3.5 转数的选择

选择最佳料液比、酶添加量及菌种比例，以4%接种量接入黑曲霉与枯草芽孢杆菌混合种子液，分别以130、140、150、160、170 r/min于30 ℃发酵提取1.5 d。测定发酵液中多糖及黄酮提取率，确定转数。

1.3.3.6 温度的选择

选择最佳料液比、酶添加量及菌种比例，以4%接种量接入混合菌种子液，分别在22、26、30、34、38 ℃温度下以150 r/min发酵提取1.5 d。测定发酵液中多糖及黄酮提取率，确定发酵温度。

1.3.3.7 时间的选择

选择最佳料液比、酶添加量及菌种比例，以4%接种量接入混合菌种子液，于150 r/min、30 ℃分别发酵提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 d。测定发酵液中多糖及黄酮提取率，确定发酵时间。

1.3.3.8 正交试验

在单因素试验基础上，选取对青钱柳多糖及黄酮提取率影响较大的接种量、温度和时间3个因素进行正交试验，以多糖和黄酮的提取率为指标，得到优化的同步提取工艺。因素水平如表1。

1.3.4 多糖和黄酮提取率的测定

多糖采用苯酚-硫酸法测定[13-15]；黄酮采用紫外分光光度法测定[16-17]。

(1)

(2)

表1 青钱柳多糖和黄酮同步提取因素水平表Table 1 Factors and levels of the synchronous extractingCyclocarya paliurus polysaccharides and flavonoids

1.4 数据处理

每个试验做3个平行，结果取平均值，并采用DPS v6.55和Excel 2007 软件处理分析试验数据。

2 结果与分析

2.1 料液比对多糖和黄酮提取率的影响

由图1可知，随着料液比的增大，多糖和黄酮的提取率均随之增加，这是由于随着料液比增大，物料与溶液间的浓度差增大[18]，同时微生物的发酵作用也增强，使得青钱柳叶中的多糖和黄酮更易溶出。当料液比为1∶20时，两者的提取率达到最大，继续增大料液比，提取率基本趋于稳定。故选择1∶20为最佳料液比。

图1 料液比对多糖和黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ratio of solid and liquid on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.2 酶添加量对多糖和黄酮提取率的影响

由图2可知，当酶添加量为0.4%时，青钱柳多糖和黄酮的提取率达到最高，分别为5.03%和4.67%，继续增大酶添加量，提取率基本无变化，说明0.4%的酶量足以酶解青钱柳叶的细胞壁，使多糖和黄酮溶出。故最佳的酶添加量为0.4%。

图2 酶添加量对多糖和黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of enzyme addition on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.3 菌种比例对多糖和黄酮提取率的影响

不同的菌种比例对青钱柳多糖及黄酮的发酵提取效果不同，由图3可知，黑曲霉与枯草芽孢杆菌的比例为1∶2时，多糖及黄酮的提取率最高，分别达5.28%和5.04%，说明此比例下两种菌通过发酵作用对青钱柳叶细胞壁的破坏作用最强，最有利于多糖和黄酮的溶出。故最适的菌种比为1∶2。

图3 菌种比例对多糖和黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of the ratio of strain on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.4 接种量对多糖和黄酮提取率的影响

由图4可知，接种量低于5%时，多糖及黄酮的提取率随着接种量的增加而增加，这是由于接种量加大，微生物增长较快，发酵提取时间减短，多糖和黄酮随着微生物的发酵从青钱柳叶中溶出。接种量为5%时，提取率达到最大，分别为5.92%和6.11%，但继续增大接种量，两种物质的提取率均下降，可能是由于微生物数量过多，导致多糖和黄酮被分解利用，使得含量减少[19]。故最佳接种量为5%。

图4 接种量对多糖和黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of inoculation size on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.5 转速对多糖和黄酮提取率的影响

不同的转速对青钱柳发酵提取多糖和黄酮的效果不同，由图5可知，随着发酵转速的增大，多糖和黄酮的提取率先增加后减少，转速为160 r/min时，两种物质的提取率最高，分别为5.57%和5.21%。转速大于160 r/min时，由于转速过大，剪切力大，易导致微生物细胞破裂死亡，不利于菌体的生长代谢，使得对青钱柳叶的发酵作用减弱，进而导致多糖和黄酮的提取率降低。故最适转速为160 r/min。

图5 转速对多糖和黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of shaking speed on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.6 温度对多糖和黄酮提取率的影响

温度对微生物的生长代谢有重要影响，它会影响菌体细胞内酶的活性及蛋白质等物质的合成[20]，从而影响青钱柳多糖及黄酮的发酵提取产量。

图6 温度对多糖和黄酮提取率的影响Fig.6 Effect of temperature on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

由图6可知，多糖和黄酮的提取率随着发酵温度的升高而先增加后降低，30 ℃时两种物质的提取率达到最高。温度过低，黑曲霉和枯草芽孢杆菌生长缓慢，温度过高，黑曲霉活性降低，生长代谢能力下降，因此过高或过低的温度均不利于微生物的发酵作用，故最佳温度定为30 ℃。

2.7 时间对多糖和黄酮提取率的影响

由图7可知，发酵时间对多糖和黄酮的提取率影响较大，发酵2 d，多糖及黄酮的提取率最高，分别达6.17%和6.09%。低于2 d时，2种物质的提取率均随着时间的增加而增加，这是由于多糖和黄酮随着微生物的发酵而逐渐被溶出，继续延长发酵时间，两种物质的提取率反而下降，可能是由于发酵液中的营养物质被耗尽导致菌种的发酵能力减弱，以及已溶出的多糖和黄酮被分解利用。因此最佳的发酵时间为2 d。

图7 发酵时间对多糖和黄酮提取率的影响Fig.7 Effect of time on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.8 正交优化试验结果

对正交试验所得数据进行分析处理，正交试验结果见表2，多糖提取率方差分析结果见表3，黄酮提取率方差分析结果见表4。

表2 正交优化试验结果Table 2 Results of orthogonal experiments

由表2极差分析结果可知，影响多糖提取率的主次因素依次为接种量>时间>温度，影响黄酮提取率的主次因素依次为温度>接种量>时间，通过直观分析初步得到对于多糖的提取率而言较佳方案为A2B3C2，对于黄酮的提取率而言较佳方案为A2B2C2。

表3 多糖提取率方差分析结果
Table 3 Variance analysis of polysaccharides extractionyield

变异来源平方和自由度圴方F值P值显著性A(接种量)2.699821.349967.456 40.014 6∗B(温度)0.396420.19829.905 10.091 7C(时间)1.146320.573128.641 30.033 7∗误差0.040020.0200

注：**表示P<0.01，差异极显著；*表示0.01

表4 黄酮提取率方差分析结果
Table 4 Variance analysis of flavonoids extraction yield

变异来源平方和自由度圴方F值P值显著性A(接种量)0.925 120.462 522.961 40.041 7∗B(温度)1.470 420.735 236.497 00.026 7∗C(时间)0.035120.0175 00.870 90.534 5误差0.040 320.020 1

由表3和表4方差分析结果可知，接种量对青钱柳多糖及黄酮提取率的影响均显著，温度对多糖提取率的影响不显著，而对黄酮提取率的影响显著，发酵时间对多糖提取率的影响显著，而对黄酮提取率的影响不显著。故综合考虑多糖及黄酮提取率的极差分析和方差分析结果，可得出多糖及黄酮同步提取的最佳方案为A2B2C2。经验证采用此方案发酵提取青钱柳多糖和黄酮，两种物质的提取率分别达7.57%和6.98%，因此青钱柳多糖及黄酮同步提取的最佳工艺为接种量5.0%、发酵温度为30 ℃、发酵时间2 d。

3 结论

采用微生物发酵技术对青钱柳多糖和黄酮进行同步提取，通过单因素及正交试验优化了多糖和黄酮的同步提取工艺，得到最佳提取工艺为：青钱柳叶以1∶20的料液比与水混匀，添加0.4%的纤维素酶-半纤维素酶复合酶进行酶解，再按照5.0%接种量接入菌种比为1∶2的黑曲霉与枯草芽孢杆菌混合种子液，于160 r/min、30 ℃发酵提取2 d，最终得到青钱柳多糖的提取率达7.57%，黄酮的提取率达6.98%，远高于XIE等[21]采用超声波提取法提取青钱柳多糖(得率为4.91%)和郝翻[22]采用有机溶剂提取法提取青钱柳黄酮(得率为3.055%)，极大提高了青钱柳多糖和黄酮的提取率及原料的利用率。