电针“委中”对多裂肌损伤大鼠MG激活的影响*

白玉琢,徐 菁,陈 洁,张佳怡,许 玥,鲁 曼,李欣怡,霍则军,张 莉△

(1.北京中医药大学,北京 100029；2.北京大学第三医院,北京 100191)

腰痛作为针灸和骨伤科门诊常见的疾病之一，在成年人群中的发病率为60%，且病情容易反复，对患者的正常工作生活产生了一定的困扰[1]。多裂肌损伤关系到脊柱的核心稳定性，在腰痛的发病过程中扮演重要角色。当腰多裂肌受到外力挫伤、机械牵拉或化学刺激等异常因素的刺激时会引起局部组织的炎症反应，同时伴有伤害性刺激信号的向上传递。有学者研究发现，在组织损伤的过程中，中枢小胶质细胞发挥着重要作用。机体损伤后，小胶质细胞作为中枢的免疫细胞，被炎性细胞因子激活后对伤害性刺激做出免疫应答，以减轻组织损伤[2-12]。临床中针灸治疗腰痛的应用广泛，其疗效也经过循证医学研究的证实。本研究以电针“委中”为干预方式，拟观察电针“委中”对腰多裂肌损伤大鼠模型多裂肌局部的炎症指标、脊髓和海马MI型小胶质细胞激活后的典型标志物iNOS含量的变化，旨在探讨电针“委中”对多裂肌损伤后脊髓和海马小胶质细胞的影响，为电针治疗多裂肌损伤所致的腰痛提供部分依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究选取SPF级SD雄性大鼠40只，体质量为(280±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可：SCXK(京)2016-0006]。动物饲养于北京中医药大学针灸机理实验室，以普通大鼠饲料喂养，饲养室温度(20±1)℃，湿度50%。大鼠适应性饲养1周后，随机抽取空白组8只，剩余大鼠全部参与造模。本实验动物的使用符合科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

1.2 造模方法

本实验采用布比卡因盐酸盐(Sigma公司)多裂肌注射法制备腰多裂肌损伤型腰痛大鼠模型[13]。剩余大鼠称重后按10%的水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，操作过程保持无菌。确定大鼠L4、L5棘突后使用4号一次性注射器抽取0.5%布比卡因溶液在L4～L5棘突水平的双侧多裂肌处注射100 μL。进针过程中保持针头紧贴棘突骨面进入多裂肌，当针头接触到关节突和乳突所在骨面回抽无血则表明针头已到达腰多裂肌注射点，注射时间应≥3 s，以利于药物的吸收。完成整个造模过程共注射4个点(L4、L5棘突水平左右各1点)，每点注射100 μL。见图1。

图1 L4～L5水平多裂肌注射点(双侧)

1.3 分组及干预方式

空白组(n=8)：不做任何处理，只做观察，与其它组大鼠同步取材。

模型组(n=16)：造模后随机抽取模型1天组8只和模型3天组8只，观察完成后同步取材。

电针组(n=16)：随机抽取电针1天组8只和电针3天组8只。将大鼠固定在特制的固定器上，暴露后肢。选取“委中”穴，参照《实验针灸学》(李忠仁，新世纪全国高等中医药院校规划教材，中国中医药出版社)常用实验动物穴位图谱，选取双侧“委中穴”(膝关节背面正中)。用华佗牌0.30 mm×13 mm一次性针灸针，针刺后连接韩式电针仪(HANS-100B)，2/100 Hz的疏密波，电流强度1～2 mA，持续20 min，1次/天。每组分别在治疗的第1天、3天的时间点同步取材各8只。

1.4 取材与检测

各组大鼠称重后以10%水合氯醛(350 mg/kg)行腹腔注射麻醉后取材。剔除大鼠背部皮毛、浅筋膜，充分暴露腰部肌肉，剥离竖脊肌和髂肋肌，锐性切除L4和L5节段多裂肌组织，取多裂肌置于4%多聚甲醛溶液中固定氮保存。冰盘上取腰椎脊髓，暴露腰椎，骨咬剪断下端腰椎，以剪刀延椎板两边剪开腰段脊髓，液氮保存，待测。断头取脑，冰袋上迅速分离出大鼠海马，置于液氮中保存待检测。

1.5 指标检测

将备好的多裂肌组织、脊髓组织、海马组织高速离心后的组织上清液按照1∶30倍的洗涤液用去离子水稀释后搅拌均匀低温保存。采用酶联免疫吸附法检测多裂肌组织中的IL-6、TNF-α、iNOS，脊髓和海马组织中的iNOS含量。

从试剂盒中取出标准品，按照6 000～10 000 rpm高速离心30 s。取5个1.5 mL离心管(S5～S1)依次排列，各加入150 μL样本稀释液，吸取150 μL标准品到第1个离心管中(S5)，轻轻混匀，从S5中吸取150 μL到第2个离心管(S4)，轻轻混匀，依次对标准品倍比稀释。将各种试剂移至室温(18～25℃)下平衡静置30 min后按前述方法配制试剂，备用。分别设空白孔(空白孔不加样品及酶标试剂，其余步骤相同)、标准品孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样品50 μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育30 min后弃去液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，250 μL/孔，甩干。每孔加酶标试剂50 μL，覆上新的板贴，37℃温育30 min后弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。每孔依序加入底物溶液A 50 μL、底物溶液B 50 μL，37℃避光显色10 min。依序在每孔中加入终止液50 μL，终止反应。在反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。

1.6 统计学分析

2 实验结果

2.1 各组大鼠多裂肌组织IL-6、TNF-α、iNOS含量比较

与空白组比较，模型1天组多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量显著升高(P<0.01),模型3天组多裂肌IL-6、iNOS的含量升高(P<0.05),TNF-α的含量显著升高(P<0.01);与模型1天组比较，模型3天组多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量降低(P<0.05),电针1天组多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS的含量显著降低(P<0.01)；与模型3天组比较，电针3天组多裂肌IL-6、iNOS含量虽有降低但未见统计学差异(P>0.05)，TNF-α含量显著降低(P<0.01)；与电针1天组比较，电针3天组多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量虽有降低但未见统计学差异(P>0.05)。见表1、图2。

表1 各组大鼠多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量比较

注：与空白组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型1 d组比较，■P<0.05,■■P<0.01;与模型3 d组比较，△P<0.01。

注：与空白组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型1 d组比较，■P<0.05,■■P<0.01;与模型3 d组比较，△P<0.01。图2 各组大鼠多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量比较

2.2 各组大鼠脊髓和海马组织iNOS含量比较

与空白组比较，模型1天组和模型3天组脊髓和海马的iNOS含量升高(P<0.05或P<0.01)；与模型1天组比较，模型3天组和电针1天组脊髓和海马的iNOS含量降低(P<0.05或P<0.01)；与模型3天组比较，电针3天组脊髓和海马的iNOS含量虽有降低但未见统计学差异(P>0.05)；与电针1天组比较，电针3天组脊髓和海马的iNOS含量虽有降低但未见统计学差异(P>0.05)。见表2、图3。

2.3 大鼠多裂肌、脊髓、海马组织iNOS含量的比较

总体来看，模型1天组多裂肌iNOS含量>脊髓>海马，模型3天组脊髓和多裂肌iNOS含量>海马，电针1天组和电针3天组脊髓iNOS含量>多裂肌>海马,电针1天组海马iNOS含量降低最显著。见图4。

表2 各组大鼠脊髓和海马iNOS含量比较

注： 与空白组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型1 d组比较，■P<0.05,■■P<0.01。

注： 与空白组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与模型1 d组比较，■P<0.05,■■P<0.01。图3 各组大鼠脊髓和海马iNOS含量的比较

图4 各组大鼠多裂肌、脊髓、海马iNOS含量比较

3 讨论

多裂肌损伤和腰痛的发生关系密切。既往研究[14]表明，小胶质细胞在组织损伤信号的传递和调节中发挥重要作用。小胶质细胞是广泛分布于脊髓、大脑皮质、海马组织中神经免疫细胞。组织损伤后，受损的感觉神经元释放的CCL2、CX3CL1、NRG1、MMP-9及CSF1等趋化因子与脊髓小胶质细胞膜上的受体相结合后促使小胶质细胞向受损部位聚集[13,15-18]。

团队前期研究[19-22]发现，布比卡因注射后可引起大鼠腰多裂肌纤维的大面积坏死，注射24 h后即可出现局部多裂肌肌纤维的大量变性坏死和肌细胞结构的破坏，组织局部炎症明显，巨噬细胞分泌大量的炎症细胞因子。IL-6、TNF-α、iNOS是典型的炎性因子，损伤早期由巨噬细胞分泌，有学者[23-24]在脊髓损伤模型早期观察到TNF-α、IL-1β等炎性因子的含量升高，高浓度的炎性因子刺激局部伤害性刺激感受器后使感觉神经元敏化进而激活脊髓和海马M1型小胶质细胞。小胶质细胞M1型具有强烈的吞噬功能，在吞噬坏死细胞器的过程中也分泌iNOS和活性氧等促炎因子，加重炎症反应和组织损伤。iNOS作为M1型小胶质细胞的表面特殊标记物，其含量反应了小胶质细胞的激活状态[25]。

针灸是非药物疗法中治疗腰痛的理想方式，委中穴属于膀胱经的合穴，是临床治疗腰痛首选的远端穴[26]。在基础研究方面，电针对多裂肌损伤的治疗作用已有研究证实，电针“委中”可通过调节肌卫星细胞的增殖分化,促进多裂肌损伤后的再生修复[27]。电针调控脊髓和海马小胶质细胞的激活也是治疗AD、PD以及髓核型腰痛等疾病的重要机制。有研究[28-29]发现，电针可通过调控海马组织中的炎性因子IL-1β和TNF-α相关基因的表达抑制M1型小胶质细胞的过度激活,保护AD大鼠的神经元。电针可通过抑制小胶质细胞M1型的过度激活,减轻脊髓后角的炎症损伤。

本研究发现，模型1天组多裂肌炎性因子IL-6、TNF-α、iNOS含量显著高于空白组，脊髓和海马iNOS含量显著高于空白组，表明在多裂肌急性损伤期，多裂肌、脊髓、海马均表现为炎症反应；模型3天组多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量低于模型1天组，脊髓和海马的iNOS含量低于模型1天组，表明造模3天后多裂肌、脊髓和海马的炎症反应开始减弱，这可能是因为造模3天后损伤组织开始修复；电针1天组多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量，脊髓和海马的iNOS含量均显著低于模型1天组；电针3天组多裂肌IL-6、TNF-α、iNOS含量，脊髓和海马的iNOS含量和模型3天组比较未见统计学差异，这表明，电针“委中”治疗1天后可显著降低多裂肌、脊髓和海马的炎性因子含量。而比较多裂肌、脊髓、海马的iNOS含量，可以发现，模型1天组多裂肌iNOS含量>脊髓>海马，模型3天组脊髓和多裂肌iNOS含量>海马，电针1天组和电针3天组脊髓iNOS含量>多裂肌>海马，而电针1天组海马iNOS含量降低最显著。这表明电针“委中”可有效降低腰多裂肌损伤模型大鼠多裂肌局部和中枢炎性因子IL-6、TNF-α、iNOS的含量，在一定程度上抑制脊髓和海马M1小胶质细胞的激活，这种效应主要体现在损伤急性期，然而关于电针“委中”通过何种途径抑制M1型小胶质细胞的激活则需要在今后的研究中完善。