合募配穴针刺对慢性酒精肝损伤大鼠模型的保护作用*

姜 阳,王朝辉,李 丽,穆双双,徐维茵,杨秀璐

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

中国酒文化深入人心，饮酒人数庞大，新生代成为酒类消费的主力军[1]，酒文化给我们带来生活上的精彩时也给我们带来一些负面效应，饮酒不当易造成肝损伤，并且酒精性肝病的患病率有上升趋势[2-3]。慢性酒精性肝损伤初期通常分成以下几个阶段，脂肪肝阶段、酒精性肝炎阶段、肝纤维化和肝硬化阶段[4]，而饮酒是肝性疾病变化发展的主要因素[5]。目前治疗酒精肝以西药为主，患者经济负担较重并且西药有一定副作用，所以推广经济安全的方法具有实际意义，而针灸学在此方面有很大扩展空间。

期门为肝经募穴，足三里为胃经下合穴，《金匮要略》中开篇提到:“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”。所以本次实验选用合募配穴治疗大鼠酒精肝。笔者导师王朝辉教授进行过相关腧穴配伍理论以及实验研究，发现合募配穴在防治脏腑病方面令人满意[6]，其他研究者也有此发现[7-9]。本次试验通过观察针刺酒精肝大鼠模型期门和足三里，探讨合募配穴对酒精肝大鼠肝脏保护作用，为进一步探讨其机制提供理论准备。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠40只，2月龄，SPF级，体质量180～210 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。合格证号[SCXK(辽)2015-0001]。40只SD大鼠采用随机数字表法随机分为空白组(A)、模型组(B)、针刺组(C)、阳性药物组(D),每组10只。

1.2 主要试剂

测IV型胶原(IV-C)ELISA检测试剂盒(南京建成科技有限公司,产品批号：20171207)、(HYP)ELISA检测试剂盒(南京建成科技有限公司,批号：20171210)、苏木精-伊红染色液(南京建成科技有限公司,产品批号：20171105)、43°牛栏山二锅头白酒(北京顺鑫股份有限公司,产品批号：20170418)、52°牛栏山二锅头白酒(北京顺鑫股份有限公司，产品批号:20170108)、0.9%生理盐水(山东科伦药业有限公司，产品批号:D160903082)和水飞蓟宾(天津天士力圣特制药有限公司,产品批号：750609060)。

1.3 实验仪器

Rayto RT-6000酶标仪(上海天呈医流科技股份有限公司)、TGL16M 台式高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)、AUY220精密电子天平(日本岛津公司)。

1.4 其他器材

华佗牌针灸针(规格：0.25×60 mm,苏州医疗用品厂有限公司)。

1.5 大鼠造模

酒精灌胃法是一种常用的慢性肝损伤造模方法，造模成功率高，操作方便，应用较广泛[10-11]。B、C、D组大鼠适应3天后开始灌胃造模，前16天为适应性酒灌胃:前4天灌胃43°牛栏山二锅头，灌胃剂量为0.2 mL/20 g/d,分为早晚梯度灌胃;5～12天灌胃43°牛栏山二锅头，灌胃剂量为0.3 mL/20 g/d,分为早晚梯度灌胃;13～16天灌胃52°牛栏山二锅头，灌胃剂量为0.3 mL/20 g/d,分为早晚梯度灌胃。16天后灌胃52°牛栏山二锅头0.3 mL/20 g/d,造模4周。4周后进行预实验，尾部取血，测ALT、AST,检验造模是否成功。

1.6 干预方法

造模成功后针刺组(C)进行针刺，模型组(B)只捆绑不针刺，空白组(A)不做任何处理，阳性药物组(D)给予药物进行治疗。阳性药物组灌水飞蓟宾生理盐水溶液(1 mL/100 g/d)。针刺组依据《常用实验动物穴位定位图谱》进行穴位定位，足三里穴：腓骨小头前下5 mm处;期门：第6肋间。取大鼠双侧穴位，常规消毒，毫针均内下斜刺0.5～1 cm,留针60 s,治疗4周。

1.7 标本采集及指标检测方法

1.7.1 肝组织观察 针刺4周后结束实验，腹主动脉取血，取脏器，测相应指标。取大鼠肝组织经10%中性缓冲甲醛液固定、取材、乙醇梯度脱水、石蜡包埋切片、苏木精和伊红染色(H&E)，在100倍光镜下观察。

1.7.2 血清学肝功能测定 取大鼠血液0.5 mL，放置在干燥玻璃管内，37 ℃保温30 min，4 ℃冰箱静置2 h，2 000 min，离心10 min，取血清，-80 ℃保存，自动生化分析仪检测肝功能指标ALT和AST。

1.7.3 肝脏组织IV-C、HYP检测 大鼠经10%水合氯醛溶液(0.4 mL/100 g)麻醉后，腹主动脉取血并提取血清，用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清中HYP、IV-C含量。

1.7.4 Western blot 将肝组织置于冰冷的裂解液收集裂解物总蛋白，组织蛋白行SDS-PAGE 并转印至PVDF膜；室温封闭2 h，与 TGF-β一抗孵育，膜经漂洗后再与辣根过氧化物酶偶联的二抗反应，增强化学发光法(ECL)发光试剂显影，灰度成像软件(UVP，UK)测定主带的光密度值以计算TGF-β蛋白表达水平。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织观察结果比较

A组光镜下观察，肝小叶结构清晰完好，肝细胞内未见明显变性、坏死，肝窦未见明显的淤血扩张。B组肝脏病理组织损伤最为严重，肝细胞核膨化，C、D组肝组织病理形态均较B组有所减轻，肝组织均出现肝细胞肿胀、胞质疏松等，少部分可见小灶性或单一细胞坏死，并伴随有轻微的炎症细胞浸润。见图1。

注：A空白组;B模型组;C针刺组;D阳性药物组。图1 各组大鼠肝组织HE染色比较(100×)

2.2 各组血清肝功能指标水平比较

与空白组相比，模型组血清中ALT及AST水平显著提升(P<0.01)；与模型组相比，治疗后针刺组与阳性药物组血清ALT及AST水平均降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 血清中AST及ALT变化

注：与空白组比较，###P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

2.3 各组血清肝纤维化指标水平比较

与空白组相比，模型组中肝组织IV-C、HYP水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗4周后相较于模型组，针刺组肝组织中IV-C、HYP水平均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 血清中IV-C和HYP变化

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.4 各组Western blot结果比较

2.4.1 各组肝组织中TGF-β蛋白表达结果比较 与空白组相比，模型组肝组织中TGF-β蛋白表达水平提高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，治疗后针刺组、阳性药物组TGF-β蛋白表达结果水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 肝组织中TGF-β蛋白水平

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

2.4.2 各组TGF-β蛋白条带结果比较 同空白组相比，模型组TGF-β蛋白表达有明显提升；同模型组相比，针刺组，阳性药物组TGF-β蛋白表达均有所下降。见图2。

图2 TGF-β蛋白条带

3 讨论

有研究表明慢性酒精肝的致病机理主要包括酒精代谢、氧化应激及炎症反应等[12]。连续给予酒精刺激可使肝细胞变性、坏死，产生炎症反应。此次试验对大鼠进行酒精灌胃造模，模型组肝细胞核膨化，肝组织均出现肝细胞肿胀，胞质疏松，切片结果显示本次试验造模成功。对酒精肝大鼠进行干预针刺，针刺后大鼠肝组织膨化减轻，肝细胞肿胀程度减轻，这说明合募配穴(足三里配期门)对大鼠肝脏具有保护作用。

ALT主要储存于肝细胞的细胞浆内，AST主要存在于肝脏组织中，当肝功能异常或肝组织损伤时，血清中ALT、AST水平会显著提高。临床上把ALT、AST作为评价肝功能正常与否的重要指标之一[13-16]。本实验观察发现，针刺足三里及期门穴后，慢性酒精肝大鼠血清中的ALT、AST水平显著降低(P<0.01)。这说明针刺足三里、期门能够在一定程度上保护肝功能，抑制肝损伤。

慢性酒精肝的一个重要病理过程是肝纤维化，一旦纤维化得不到控制便会发展为肝硬化[17]。肝纤维化的主要表现是以胶原蛋白为主的细胞外基质(ECM)大量增生和沉积[18]。 肝组织中Hyp含量较稳定,其在肝中的含量可反映胶原代谢的变化情况[19]。研究表明，IV-C是组成基底膜的主要成分, 在细胞分化和基因表达中扮演重要角色,因此IV型胶原(IV-C)也是反映肝纤维化程度的良好指标[20]。此次实验中，针刺组中肝组织中IV-C、HYP水平均降低，这提示针刺足三里穴配期门穴能够减缓肝纤维化进程，进而减轻肝损伤，起到保护肝脏的作用。

根据相关报道，星状细胞(HSC)在肝损伤产生的炎症因子、氧化重构、脂质过氧化、免疫应答等刺激下，大量产生 TGF-β、CTGF等细胞炎性因子[21]。TGF-β/Smads信号通路是TGF-β下游经典的信号通路[22]。TGF-β是促纤维化主要细胞因子之一，HSC的激活是一个级联反应过程，其过程对于TGF-β/Smads通路而言，TGF-β是启动因子[23]。TGF-β是Ⅰ型胶原基因转录刺激因子，当TGF-β与其受体结合后激活 Smad-3并磷酸化，与 Smad-4形成异源三聚体复合物入核，与DNA 结合，调控Ⅰ型胶原基因的转录和表达，促进HSC合成Ⅰ型、Ш型、IV 型胶原等，最终提高HYP、IV等型胶原在肝组织中含量[24]，增加组织纤维化程度。本次实验TGF-β蛋白表达水平及条带说明，针刺可降低大鼠肝组织中TGF-β蛋白表达进而抑制肝纤维化，依据本次实验数据推测，合募配穴针刺可能通过TGF-β/ Smads信号通路来抑制肝纤维化。

阻断或逆转慢性肝损伤中纤维化发生和发展是治疗慢性肝病的关键，西医对慢性肝损伤治疗尚缺乏有效办法。中医对肝病的认识历史悠久，酒精肝在中医的专业术语里称为“酒疸”。中医理论认为,肝纤维化、肝硬变的重要原因是“久病入络”。针灸能够调畅气血、疏通经络、调和阴阳，恢复脏腑功能，并且不经肝肾代谢，减轻肝肾负担。期门穴乃肝经募穴，是调理肝气、调畅气机之要穴[25]，足三里为胃经下合穴，具有扶正祛邪、通降腑气之功[26]，合募配穴，上下相应，能增强穴位主治，扩大治疗范围。本次实验表明,通过合理配穴针刺能够在一定程度上减缓肝损伤，抑制肝纤维化，保护肝功能,为针刺治疗肝脏病提供治疗思路。