Clusterin蛋白和Bim蛋白在非梗阻性无精症睾丸组织中的表达及意义

傅文婷，江惠华，周冰燚，赵文忠，钟兴明，朱志勇，刘晓阳，刘兴章

(广东省计划生育科学技术研究所 广东省计划生育专科医院国家卫生健康委员会男性生殖与遗传重点实验室,广州 510700)

非梗阻性无精症是临床常见的男性不育的原因，无精症的发生机制较为复杂，与遗传、免疫内分泌异常等因素密切相关，如基因片段的突变，染色体的微缺失以及生殖激素水平失衡等，导致生精发生障碍[1-2]。其中凋亡机制的异常激活是导致无精症发生的原因之一。Clusterin蛋白和Bim蛋白是与细胞凋亡密切相关的蛋白质，Bim属Bcl-2家族，能够诱导细胞的程序性凋亡，如通过激活细胞色素C途径诱导caspase的级联反应，诱导细胞的凋亡，此外能够抑制抗凋亡因子的表达，抑制其抗凋亡活性，并且能够在翻译及转录水平诱导细胞凋亡，其过表达可能导致精子在生发过程中进入异常的凋亡程度，导致精子的形成及成熟障碍[3]。Clusterin是一种分泌性糖蛋白，其能通过多种途径抑制细胞凋亡程序的启动，并且能够诱导细胞的分化以及DNA的修复，对细胞周期进行调节，参与生殖、脂质转运、内分泌系统功能调节等作用[4]。研究显示，Clusterin蛋白及Bim蛋白参与生精细胞的精子形成过程[5-6]。本研究主要分析Clusterin蛋白及Bim蛋白在原发性少精子症发生及进展中的作用，为无精症发病机制研究进一步提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年2月至2018年8月广东省计划生育科学技术研究的32例无精症患者睾丸组织标本作为无精症组，患者年龄26～41岁，平均(33.0±2.1)岁。入选标准:①连续3次精液检查无精子；②睾丸病理学检查无精子生成；③除外隐睾、精索静脉曲张等因素导致的生精障碍；④除外附睾炎等感染、免疫因素导致的生精障碍。选择外伤切除睾丸组织标本30例作为对照组，患者年龄29～47岁，平均(34.1±1.8)岁。两组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经广东省计划生育科学技术研究所医学伦理委员会批准。

1.2 主要仪器及试剂 睾丸组织标本(来自本院非梗阻性无精症患者穿刺活检标本及外伤性睾丸切除手术标本)，兔抗人Bim多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，兔抗人Clusterin多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)，组织化学免疫染色试剂盒(浙江碧云天生物技术研究所)，羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶(浙江碧云天生物技术研究所)，乙二胺四乙酸抗原修复液(南京建成生物技术研究所)，恒温水浴箱、切片机、显微镜等仪器由本院中心实验室提供。

1.3 染色方法 睾丸组织标本采用免疫组织化学法进行染色，标本常规采用40%甲醛固定后石蜡包埋，切片机连续切片，切片厚度2 μm，切片后60 ℃烤片1 h，脱蜡水化，二甲苯溶液中浸泡10 min后更换溶液重新浸泡10 min，然后用无水乙醇和95%乙醇及75%乙醇溶液依次浸泡5 min，再用3%双氧水浸泡10 min,蒸馏水冲洗3次。然后用0.01 mmol/L枸橼酸溶液浸泡切片，微波最大火力加热至沸腾后冷5～10 min，反复2次，修复暴露抗原，切片自然冷却后采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤5 min,重复3次，滴加3%过氧化氢消除内氧化物酶活性，然后用PBS洗涤5 min，重复3次，滴加1抗，37 ℃温育1 h，然后PBS洗涤，每次3 min,洗涤3次后滴加2抗，37 ℃温育30 min，然后PBS洗涤，每次3 min,洗涤3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37 ℃温育30 min，然后PBS洗涤，每次3 min,洗涤3次，滴加二氨基联苯胺显色，温育5 min充分反应，流水及蒸馏水冲洗后采用苏木素复染2 min，流水冲洗后乙醇固定、二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 观察指标和判断方法 睾丸组织免疫组织化学标本镜检观察，采用积分法对表达情况进行评估，在400 ×光镜下选择5个无交叉视野， Clustering蛋白和Bim蛋白表达位置位于生精细胞的胞质中，表现为淡蓝色背景下褐色或棕色颗粒状染色物质，染色阳性强度评估为每个视野中阳性生精细胞占总细胞数的百分比，其中1%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～80%计3分，>80%计4分。染色的强度计分按染色的着色程度，其中无着色为0分，弱着色为1分，中等着色为2分，明显着色为3分，评估总得分为阳性强度评分和染色强度评分，其中无表达为0分(-)，轻度表达为1～3分(+)，中度表达为4～7分(++)，高度表达为8～12分(+++)[7]。

2 结 果

2.1 非梗阻性无精症患者睾丸组织Clusterin蛋白及Bim蛋白的表达情况 Clusterin蛋白及Bim蛋白主要在睾丸组织生精细胞胞质内表达，阳性表达者表现为生精细胞内极细胞膜不均匀颗粒样或团块样棕褐色染色物质。

2.2 两组睾丸组织Clusterin蛋白表达强度及表达阳性率比较 Clusterin蛋白在对照组睾丸组织中以强阳性表达为主，在无精症组以中等阳性和弱阳性为主，无精症组Clusterin蛋白表达阳性强度及阳性率均低于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组睾丸组织Clusterin蛋白表达强度及表达阳性率比较

对照组：外伤切除睾丸组织标本；a为Z值，b为χ2值

2.3 两组睾丸组织Bim蛋白表达强度及表达阳性率比较 Bim蛋白在对照组睾丸组织以阴性和弱阳性表达为主，在无精症组以中等阳性和强阳性为主，无精症组Bim蛋白阳性强度及阳性率均高于对照组(均P<0.05)。见表2。

表2 两组睾丸组织Bim蛋白表达强度及表达阳性率比较

对照组：外伤切除睾丸组织标本；a为Z值，b为χ2值

2.4 非梗阻性无精症患者睾丸组织Clusterin蛋白与Bim蛋白的相关性 Spearman相关分析结果显示，Clusterin蛋白与Bim蛋白表达呈负相关(rs=-0.391,P=0.004)。见表3。

表3 非梗阻性无精症症患者睾丸组织Clusterin蛋白与Bim蛋白的相关性 (例)

3 讨 论

无精症是指精液中无精子检出，是男性不育症的主要原因之一。无精症包括梗阻性无精症和非梗阻性无精症， 其中非梗阻性无精症是指精子生成障碍或成熟障碍，引起非梗阻性无精症的原因较多，如性激素水平异常，自身的免疫系统疾病以及生殖系统发育缺陷等。其发病机制与遗传因素密切相关，多由于基因突变或染色体的微缺失引起。如Y染色体的无精子因子(azoospermia factors，AZF)位点的缺失，包括AZFa、AZFb、AZFc三个基因位点，其缺失均能引起精子的生成障碍[8]。此外,无精症相关缺失基因A260G、A386G位点的多态性也与无精症的发生密切相关[9]。有研究显示，特发性少精子症和无精子症患者Pygo2基因蛋白编码区单核苷酸多态性相关位点发生突变，其中单个氨基酸位点的突变能够引起Pygo2编码蛋白的空间结构发生变化，导致精子的生成障碍，发生少精子症或无精子症，说明在原发性无精症的患者中相关基因位点的表达缺陷或突变是导致无精症发生的始动因素[10]。有研究显示，精子生成障碍患者卵泡刺激素及睾丸酮等生殖相关激素的表达水平明显下降，而且生精细胞内的相关凋亡抗原的表达水平升高，生精细胞的凋亡指数明显增高，提示其精原细胞的凋亡程序激活是导致精子生成减少的直接原因之一，与生精细胞凋亡有关的细胞因子可能在无精症的发生、发展过程中发挥重要作用[11-12]。Clusterin蛋白及Bim蛋白均是与细胞凋亡密切相关的细胞因子。

Clusterin蛋白是一种分泌性糖蛋白，首先在睾丸中分离出来，具有细胞聚集活性，其能通过多种途径抑制细胞凋亡程序的启动，通过与肿瘤坏死因子相互作用减少细胞凋亡的发生[13]，也能通过抑制核因子κB和Bax/Bcl-xL信号转导途径的活性发挥对细胞凋亡的拮抗作用[4]。Clusterin蛋白和细胞质内活化的Bax相互作用能够抑制抑细胞色素C的释放，发挥细胞保护作用。生殖系统是Clusterin蛋白表达丰富部位，其与睾丸的正常生理功能密切相关，Clusterin蛋白能够抑制生精细胞及精子的凋亡。Plotton 等[14]通过对特发性无精症及获得性无精症患者的睾丸组织研究发现，非梗阻性无精症患者睾丸组织中Clusterin的表达下降，而获得性无精症患者睾丸组织中Clusterin表达水平正常，提示其可能在精子发生的始动阶段发挥对生精过程的调节作用。本研究结果显示，无精症组Clusterin蛋白的表达强度及阳性率均明显下降，表达缺失情况较为明显，提示其可能参与精子生成障碍或在精子生成过程中的某个环节导致精原细胞的凋亡。对男性不育症患者的研究发现, Clusterin蛋白水平降低能够引起精子的成熟障碍，DNA片段断裂[15]。在非梗阻性不孕症患者的精液及睾丸组织中均存在Clusterin蛋白低表达，提示其在精子生发及成熟过程中均有重要作用[16]。一项对精液的研究显示[17],Clusterin蛋白的表达水平与男性能力密切相关，精液中Clusterin蛋白水平与精子活力以及体外受精率有关，精液中Clusterin蛋白水平高的男性，其配偶受孕率明显增加，提示其在男性生育中起重要作用，可能与增加精液中精子活力及数量有关。

Bim蛋白是Bcl-2家族中BH3-only成员，能够诱导细胞凋亡程序的启动，通过激活Bax途径，引起线粒体外膜骨架改变，导致其通透性改变并释放出细胞色素C诱导凋亡蛋白酶活化因子1形成凋亡小体，激活caspase家族的级联反应，引起细胞的凋亡[18]。Bim也能通过蛋白激酶B/叉头框蛋白O3a信号转导途径的激活诱导细胞凋亡产生。同时Bim能够与Bcl-2等抗凋亡蛋白结合，降低其活动，抑制其抗凋亡作用。Bim在神经系统退行性病变及恶性肿瘤的发生及发展过程中扮演重要角色[19-20]。本研究结果显示，无精症组Bim蛋白存在过表达，其可能通过抑制抗凋亡相关信号转导过程，参与非梗阻性无精症的发病过程，非梗阻性无精症患者睾丸组织中Clusterin蛋白与Bim蛋白的表达呈负相关，说明其可能在细胞凋亡过程中相互调控，共同参与对睾丸生精功能的调节。

综上所述，在非梗阻性无精症患者睾丸组织中存在Clusterin蛋白和Bim蛋白表达异常，两者呈负相关，提示其可能通过相互调控参与精子的发生和成熟过程，共同参与非梗阻性无精症的发生及进展。