亲水作用色谱串联质谱法测定婴幼儿乳粉中的牛磺酸

阳 曦,刘 玮

(绵阳市食品药品检验所,四川绵阳 621000)

牛磺酸又称β-氨基乙磺酸,最早从牛黄中分离出来,是一种含硫的非蛋白氨基酸,不参与体内蛋白的生物合成。参与人体牛磺酸合成的半胱氨酸亚硫酸羧酶活性较低,因此牛磺酸主要依靠从食物中摄取来满足机体需要。牛磺酸作为营养活性物质,对人体有着十分重要的生理调节作用,特别是对婴幼儿的大脑发育、神经传导、视觉机能的完善和钙的吸收有良好的作用,能够增强婴幼儿免疫力,是婴幼儿食品至关重要的营养添加剂。缺乏牛磺酸,会对人体造成很多不利的影响[1]。我国国家标准GB14880-2012《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》规定，牛磺酸可作为营养强化剂在调制乳粉中使用,GB 10765-2010《食品安全国家标准 婴儿配方食品》及GB10767-2010《食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品》中,对牛磺酸使用的限量值做出了具体要求。可见,测定婴幼儿乳粉中牛磺酸的含量具有十分重要的意义。

目前,现有的国家标准对食品中牛磺酸的测定主要采用高效液相色谱法[2]。相关文献报道测定牛磺酸的主要方法有比色法[3]、高效液相色谱法[4-6]、离子色谱法[7]、薄层扫描法[8-9]、氨基酸自动分析法[10-12]、液相色谱-串联质谱法[13-14]。比色法和薄层扫描法都易受其他氨基酸的干扰,灵敏度和准确度低;高效液相色谱法多采用柱前或柱后衍生测定,样品前处理过程繁琐,不能直接对牛磺酸进行测定;离子色谱法普及性较差;氨基酸分析仪测定法所需时间较长,且需要专属仪器;高效液相色谱-质谱联用法应用越来越普遍,具有定性准确、灵敏度高、测定时间短等特点。本试验采用高效液相色谱-质谱联用法对婴幼儿乳粉中牛磺酸进行直接测定,省去复杂的前处理过程,建立对婴幼儿乳粉中牛磺酸含量的直接测定方法,以期能够快速、准确地对牛磺酸含量进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品:飞鹤、金领冠婴幼儿乳粉共10批 市售;标准物质:牛磺酸 曼哈格公司;乙腈、甲酸 色谱纯,Fisher公司;甲酸铵、亚铁氰化钾、乙酸锌 分析纯,成都市科龙化工试剂厂。

4000 Q TRAP高效液相色谱-串联质谱仪 美国AB SCIEX公司;离心机 德国eppendorf公司;MS6035电子天平、XSE205电子天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司;Direct-Q超纯水机 美国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 取试样2 g,置于50 mL比色管中,加入25 mL水,涡旋混匀后超声提取(250 W,50 kHz)20 min,再加入0.2 mol/L亚铁氰化钾溶液和1 mol/L乙酸锌溶液各1 mL,混匀,加水定容至刻度。在4 ℃下以8000 r/min离心10 min,取上清液1 mL置于100 mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀,经0.22 μm水系滤膜过滤后,待测定。

1.2.2 亲水作用色谱-串联质谱法测定婴幼儿乳粉中牛磺酸的含量

1.2.2.1 液相色谱条件 色谱柱:Poroshell 120 HILIC-Z(2.1×100 mm,2.7 μm);流速:0.4 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:2 μL;流动相A:乙腈,流动相B:10 mmol/L甲酸铵(含0.05%甲酸);梯度洗脱条件见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions of liquid chromatography

1.2.2.2 质谱条件 离子源:电喷雾电离源(ESI);扫描方式:负离子扫描;检测方式:多反应监测(MRM);离子化电压(IS):-4500 V;离子源温度(TEM):500 ℃;气帘气压力(CUR):25 psi;喷雾器压力(GS1):55 psi;辅助加热器压力(GS2):50 psi;碰撞器(CAD):Medium;碰撞室入口电压(EP):-10 V;碰撞室出口电压(CXP):-14 V;具体参数见表2。

表2 质谱分析参数Table 2 Mass spectrometric analysis parameters

1.2.2.3 质谱条件的优化 选择合适的母离子、子离子,调节碰撞能量及去簇电压。

1.2.2.4 色谱柱的选择 将普通C18和亲水作用色谱原理的Poroshell 120 HILIC-Z柱进行比较,选择保留行为好、灵敏度高、峰型好的色谱柱作为本试验色谱柱。

1.2.2.5 流动相的优化 比较乙腈-10 mmol/L甲酸铵、乙腈-10 mmol/L甲酸铵(甲酸0.05%)两种不同的流动相,优化梯度洗脱程序。

1.2.2.6 进样量的选择 将2、5、10、20 μL的标准溶液(50 ng/mL)进样,比较牛磺酸标准物质色谱峰,考察是否有容积效应带来的影响,选择合适的进样量。

1.2.2.7 沉淀方法的选择 比较固相萃取法和沉淀剂对蛋白质的沉淀效果,采用简单易行、效果好的沉淀方法。

1.2.2.8 基质效应 本试验考察样品经蛋白质沉淀、多倍稀释、色谱柱的选择对基质效应的影响。

1.2.2.9 线性关系及检出限测定 准确称取牛磺酸标准物质50.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加水溶解并定容至刻度,制成含牛磺酸1 mg/mL的标准储备液。临用时,用水稀释成标准系列溶液,牛磺酸浓度分别为10、20、50、100、200 ng/mL。将标准系列溶液进样,绘制标准曲线。稀释标准溶液,以信噪比S/N=3时对应的目标化合物含量作为该方法的检出限。

1.2.2.10 回收率及精密度实验 对样品进行3个水平的加标回收试验,计算其回收率及精密度。

1.2.3 样品测定 样品经前处理后采用1.2.2.1和1.2.2.2的仪器条件,测定市售10批婴幼儿乳粉中牛磺酸的含量。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

根据牛磺酸的分子结构,采用ESI负离子扫描模式,使用针泵连续进样,将浓度为1 μg/mL的牛磺酸准储备液泵入质谱仪,选择扫描模式为Q1 MS,找到合适的母离子,确定母离子质荷比m/z为124.0。选择扫描模式为Product lon(MS2),手动调节碰撞能量CE,以5 eV为步长,选择两个响应值最强的碎片离子作为子离子。选择扫描模式为MRM,确定牛磺酸的定性离子对,进一步优化碰撞能量和去簇电压,得到质谱最佳分析条件,见表2。

2.2 色谱柱的选择

典型的HILIC流动相是由低水相及高有机相组成,流动相中水是最强的洗脱溶剂,这样的流动相组成有利于提高电喷雾离子化质谱的灵敏度,同时还可以避免使用离子对试剂。如图1所示,用200 ng/mL的牛磺酸标准溶液进样2 μL,图1a杂峰多,保留性差;图1b杂峰少,峰型好。牛磺酸具有较强的极性,在普通的C18色谱柱上保留效果较差,而采用Poroshell 120 HILIC-Z色谱柱能有效改善其保留性,且灵敏度提高10倍以上。因此选择亲水作用色谱原理的Poroshell 120 HILIC-Z柱作为分离柱。

图1 C18色谱柱和Poroshell 120 HILIC-Z柱色谱行为的比较

2.3 流动相的优化

本试验采用乙腈-10 mmol/L甲酸铵作为流动相。考虑到婴幼儿乳粉成分比较复杂,可在目标物出峰后适当增加较大比例的水相冲洗步骤,以保护色谱柱。同时,为了使牛磺酸拥有合适的保留时间,且有比较高的离子化效率,因此本试验采用梯度洗脱程序。在10 mmol/L甲酸铵溶液中加入0.05%的甲酸,有助于改善峰形及提高灵敏度。通过不断试验,确定流动相的组成及洗脱程序如表1所示。牛磺酸标准溶液定量离子对的多反应监测MRM图见图2。

图2 牛磺酸标准溶液定量离子对的MRM图

2.4 进样量的选择

由于牛磺酸极易溶于水,难溶于纯有机溶剂,为了提高样品中牛磺酸的提取效率,本试验采用纯水相作为提取溶剂。而试验所用的Poroshell 120 HILIC-Z柱,是一款具有亲水作用的色谱柱,在液相分离模式中,溶剂的洗脱能力由强到弱为:水>甲醇>乙腈。因此,待测样品溶液由于水作为溶剂,会造成比较强的溶剂效应。当进样溶剂与流动相混合时,由于样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度,部分样品会先被洗脱流出色谱柱,使组分峰表现出峰的前伸、峰展宽、峰分叉等现象。在不改变样品提取溶剂及流动相的情况下,减少进样体积能够降低溶剂效应的影响。本试验对50 ng/mL的牛磺酸标准溶液进样,比较了进样体积为2、5、10、20 μL的谱图,如图3所示,结果表明:进样体积为5、10、20 μL时均造成了峰的变形,进样体积为2 μL时展现出良好的峰形,故本试验选择进样体积为2 μL。

图3 牛磺酸标准溶液不同进样体积的MRM图

2.5 沉淀方法的选择

乳粉中含有大量的蛋白质,所以在样品前处理时要先除去样品中的蛋白质。常用的除去蛋白质的方法有固相萃取法[15]和蛋白沉淀法[16]。固相萃取法具有净化效率高的优点,但处理过程较为繁琐且成本较高。蛋白沉淀法通过添加沉淀剂来达到净化的效果,操作简便快捷。本试验选择亚铁氰化钾和乙酸锌的混合溶液作为沉淀剂进行样品处理,能够取得满意的净化效果及回收率。

2.6 基质效应

基质是样品中被测物以外的组分,会对被测物的检测造成一定的干扰,表现为离子抑制和离子增强两种形式,一般而言,离子抑制现象更容易发生[17]。基质效应会对检测结果的准确度造成影响,严重干扰了样品的定量分析,因此,在利用高效液相色谱法-串联质谱法分析样品时,应对基质效应进行评估。消除和减少基质效应的影响,能确保数据的准确性。消除基质效应常用的方法有:使用合适的内标、选择合适的前处理方法、选择合适的色谱及质谱条件等。

婴幼儿乳粉中牛磺酸的添加量一般较高,因此待测样品溶液一般需进行多倍稀释才能在测定线性范围内。试验考察了3种婴幼儿乳粉的基质效应,提取好后的待测样品溶液均需稀释100倍之后才能进样,结果表明,稀释后并无基质效应产生。本试验采用的亲水作用色谱柱是一种以极性材料为固定相,高比例有机相为流动相的色谱柱,保留时间随极性的增强而增加。样品处理经沉淀蛋白质后,能够减少部分基质带来的影响,但是样品中的脂肪类物质并没有被去除,采用HILIC色谱柱进行测定,脂肪类物质不被色谱柱所保留,从而有效地除去了基质效应的影响。因此,本试验从样品的前处理、色谱柱的选择、稀释待测样品等几个方面消除了基质带来的干扰。

2.7 线性关系及检出限

对牛磺酸标准系列溶液进行测定,绘制标准曲线,以信噪比S/N=3时对应的目标化合物含量作为该方法的检出限,结果见表3。结果表明,牛磺酸标准品线性关系良好,相关系数为0.9997,检出限为0.04 mg/kg。

表3 牛磺酸标准品的线性范围、回归方程、相关系数及检出限Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients and LODs of taurine standard

2.8 回收率及精密度

按试验方法对样品进行3个水平的加标回收试验(n=6),加标水平及结果见表4。结果表明,牛磺酸回收率为81.2～90.5%,相对标准偏差小于4.0%,该方法具有良好的准确度和重复性。

表4 回收试验结果(n=6)Table 4 Results of recovery test(n=6)

2.9 样品的测定

采用所建立的方法对市售10批婴幼儿乳粉样品进行检测,结果表明,牛磺酸的含量与样品标示值(380 mg/100 g)基本一致,且符合国家限量要求。测定结果见表5。

表5 样品中牛磺酸含量Table 5 Taurine content in samples

3 结论

本试验建立了婴幼儿乳粉中牛磺酸的HILIC-MS/MS检测方法,样品经提取后,采用亚铁氰化钾和乙酸锌作为沉淀剂,选用Poroshell 120 HILIC-Z亲水作用色谱柱,用乙腈-10 mmol/L甲酸铵(甲酸0.05%)作为流动相进行梯度洗脱,质谱在负离子模式下采用MRM多反应监测,牛磺酸在10～200 ng/mL浓度范围线性关系良好,相关系数r为0.9997,检出限为0.04 mg/kg,回收率在81.2～90.5%之间,相对标准偏差小于4.0%。该方法快速、准确、灵敏度高、检出限低,可有效满足对婴幼儿乳粉中牛磺酸含量的直接测定。