多粘菌素B抑制丝状真菌的定量测定方法研究

王志新,李昌旺,宏 丹,宁亚维,贾英民

(1.河北科技大学生物科学与工程学院,河北省发酵工程技术研究中心,河北石家庄 050018;2.北京工商大学食品学院,北京 100048)

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一类具有抗菌生物活性小分子多肽物质的总称,具有抑制或杀灭细菌、真菌以及病毒、肿瘤的能力[1]。天蚕素是发现的第一个小分子抗菌肽[2],此后,相继从昆虫[3]、植物[4]、微生物[5-6],包括人体[7]中发现了2000多种抗菌肽。研究发现,抗菌肽具有抑菌谱广、抑菌活性高、性质稳定、不易产生耐药性等优良特性,作为抗生素的良好替代品已引起人们极大关注[1,8]。

目前市面上抗菌肽产品种类众多,但被批准使用的较少,其中乳酸链球菌素已被批准用于食品防腐剂[9],短杆菌肽S、多粘菌素B和林蛙抗菌肽可用于制造皮肤软膏[10-11],那西肽在欧盟和日本被批准用于饲用添加剂[12]。抗菌肽应用前首先要进行功效评价,然而,由于其来源广泛、结构多样、差异较大,致使其评价方法众多[5,13-15]。在活力评价方面,抗菌肽尚未形成统一的评价体系或标准方法,导致其定量测定方法不统一,产品良莠不齐、缺乏可比性,因此亟需建立和完善抗菌肽的活性测定方法,并制定相关的标准,以保证抗菌肽产业的健康发展。

关于抗菌肽抑制细菌的测定方法研究较多[5,16],而对于真菌研究主要集中在酵母菌和植物病原真菌上[10,17],对引起食品腐败菌的曲霉菌、青霉菌、毛霉菌等丝状真菌的研究较少。国内外对于抗菌肽抑制真菌能力评价方法大多借鉴抗生素的测定方法,其中应用较广泛的是微生物检定法,包括微量稀释法、平板扩散法(纸片扩散法、管碟法或打孔法)、孢子萌发抑制法和菌丝生长抑制法等[14,18-19]。其中较权威的是《中华人民共和国药典》(2015版第四部)推荐的管碟法和浊度法[20],以及美国国家临床和实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法M38-A[21]。然而,药典中评价生物活性时,需要以标准样品来标定,而抗菌肽种类多、结构复杂,利用标准样品评价时难度大;而微量稀释法若采用肉眼观察判断浑浊度具有一定误差,若采用光谱法判读则受到孢子颜色、大小和形状的影响,有学者提议针对不同指示菌采用不同的判断依据[22],但操作起来更为繁杂,应用上具有一定局限性;同时,在进行抑制丝状真菌实验时,真菌菌体较大且菌丝茂盛,因此,稀释法和扩散法不易获得准确结果,通常采用抑制孢子萌发和抑制菌丝生长这2种方法来衡量抗菌肽对丝状真菌的抑制作用。

在方法建立过程中一般采用标准物质进行研究,针对本研究而言,主要考虑的是抗菌肽和指示菌。市面上销售的抗菌肽产品种类众多,但是目前常用作标准物质的有乳酸链球菌素、那西肽、杆菌肽、短杆菌肽、多粘菌素等。文献报道显示(表1),对真菌具有抑制作用的抗菌肽有微生物源抗菌肽(杆菌肽、短杆菌肽S和多粘菌素B)、昆虫类抗菌肽(天蚕素、昆虫防御素)以及鱼类、两栖类及哺乳动物类抗菌肽。其中报道较多、使用较广的为微生物源抗菌肽——杆菌肽、多粘菌素B。多粘菌素B对真菌和革兰氏阴性菌均可以产生较好抑菌效果[10,23],杆菌肽对真菌的抑制作用稍弱于革兰氏阳性细菌[24],短杆菌肽S对真菌和革兰氏阳性菌的抑制作用较好[25],但近年短杆菌肽S的应用逐渐减少。

表1 几种常见的抗菌肽及其生物活性Table 1 Common antimicrobial peptides and the antimicrobial activities

在抗菌肽抑制真菌中,研究较多的是对植物病原菌的抑制,其指示菌一般选择镰刀菌、立枯丝核菌等[10],但对引起食品和谷物腐败或霉变的霉菌研究较少,本研究选择常用的真菌指示菌——黑曲霉和青霉[33]。由于抗菌肽对真菌的抗菌方式各不相同,所选的指示菌应具有一定代表性,一般选择标准菌株或质控菌株,综合考虑,本研究选用标准菌株A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106作为指示菌。

在丝状真菌生长培养基的选择中,文献报道大部分采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和察氏培养基[18,34],考虑PDA培养基为天然原料,制备时成分不稳定,而察氏培养基为化学合成原料,成分稳定,因此,测定方法标准化时考虑重现性等问题,本研究优先选择察氏培养基作为丝状真菌生长的培养基。因此,本研究以多粘菌素B为抗菌肽研究对象,以黑曲霉和产黄青霉为指示菌,通过比较孢子萌发抑制法和菌丝生长抑制法筛选抗菌肽抑制丝状真菌的定量测定方法,并进一步优化该方法的最适测定条件,为解决抗菌肽评定指标不统一、评价方式混乱等问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉(AspergillusnigerATCC 16404)、产黄青霉(PenicilliumchrysogenumATCC 10106) 本实验室保存;多粘菌素B(polymyxin B)、杆菌肽 USP级,上海麦克林生化科技有限公司;合成肽(天蚕素Cecropin A、天蚕素Cecropin B、滑爪蟾素Magainin Ⅱ、黑斑侧褶蛙素Esculentin-1A、防御素LL-37) 90%,上海强耀生物科技有限公司;马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB) BR级,北京索莱宝生物科技有限公司;一次性平板(Φ=90 mm) 江苏康健医疗用品有限公司。

CX31显微镜 日本奥林巴斯株式会社;CD-15AX游标卡尺 日本Mitutoyo(三丰)有限公司;Scan1200全自动菌落计数仪 法国Interscience公司;OMP200A分析天平 上海精密仪器有限公司;打孔器 泰州市刁铺光学仪器有限公司;SW-CJ-1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;ZSD-A1160恒温培养箱 上海智城分析仪器制造公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 察氏培养基:氯化钾0.5 g/L、蔗糖30.0 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L、磷酸氢二钾1.0 g/L、硝酸钠3.0 g/L、无水硫酸镁0.5 g/L和琼脂20.0 g/L、121 ℃高压蒸汽灭菌15 min备用。

1.2.2 指示菌孢子悬液及菌饼制备 孢子悬液制备:取麸皮管中保藏的指示菌接种于察氏培养基上,28 ℃恒温培养3 d,用0.5%葡萄糖溶液洗脱孢子,血球计数板计数,将孢子悬液调整至106个/mL,备用。菌饼制备:将上述制备的孢子悬液,取100 μL涂布于察氏培养基,28 ℃恒温培养24～30 h,待菌丝长满平板后,用灭菌打孔器自菌落边缘切取菌饼,备用。

1.2.3 抗菌肽筛选 按照1.2.2的方法制备A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的孢子悬液,并涂布100 μL于察氏培养基,获得检测平板。将多粘菌素B、杆菌肽和5种合成肽分别配制成1 mg/mL的多肽溶液,参照中国药典(2015版第四部)抗生素的管碟测定法[20],在上述制备的检测平板上放入牛津杯,每杯添加100 μL多肽溶液,4 ℃预扩散6～10 h,取出放入28 ℃的培养箱中培养24～30 h,测量抑菌圈直径。

1.2.4 多粘菌素B抑制丝状真菌评价方法筛选

1.2.4.1 孢子萌发抑制法 配制10.00 mg/mL的多粘菌素B溶液,然后分别与1.2.2制备的孢子悬液等体积混合进行二倍梯度稀释,得到多粘菌素B终浓度为0.16、0.31、0.63、1.25、2.50和5.00 mg/mL,然后分别滴加入凹玻片中,架放于带有浅层水的培养皿中,加盖保湿,28 ℃培养8～18 h,并以不加多粘菌素B的作对照。每个实验组随机观察3个以上视野,调查孢子总数应大于200个,分别记录各组萌发情况和孢子总数(孢子萌发:孢子牙管长于孢子短半径)。根据式(3)[35]计算实验组的孢子萌发相对抑制率,以多粘菌素B浓度的对数值为横坐标,通过生物统计几率值换算表,以相对抑制率对应的几率值为纵坐标,计算每个实验浓度的回归方程和相应的EC50值。

式(1)

式中:R:孢子萌发率(%);Ng:孢子萌发数(个);Nt:孢子总数(个)。

式(2)

式中:Re:实验校正孢子萌发率(%);Rt:实验组孢子萌发率(%);R0:对照组孢子萌发率(%)。

式(3)

式中:I:孢子萌发相对抑制率(%);R0:对照组孢子萌发率(%);Re:实验校正孢子萌发率(%)。

1.2.4.2 菌丝生长抑制法 配制浓度为5.00、10.00、20.00、30.00、40.00和50.00 mg/mL的多粘菌素B溶液,分别取5 mL与冷却至50 ℃的察氏培养基混匀,培养基中多粘菌素B最终浓度分别为0.17、0.33、0.67、1.00、1.33和1.67 mg/mL。将含有多粘菌素B的察氏培养基倒入平板,每个平板20 mL,制备含多粘菌素B的平板,以不含多粘菌素B的平板作对照。参照Chen等[36]的菌丝生长抑制法加以修改,将含肽平板用打孔器打孔留空,然后将1.2.2中制成的直径(5.80±0.02) mm的A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106菌饼分别接种于留空处,菌丝面朝上,28 ℃培养。根据对照组平板中菌丝生长情况观察实验组的生长情况,游标卡尺测量菌丝直径,每一个菌落采用十字交叉法垂直测量各一次,取其平均值。

按照式(5)计算各实验组对指示菌的生长抑制率[37],以多粘菌素B浓度的对数值及菌丝生长抑制率对应的几率值进行回归性分析,计算多粘菌素B的EC50值。

D(mm)=D1-D2

式(4)

式中:D:菌落增长直径(mm);D1:菌落直径(mm);D2:菌饼直径(mm)。

式(5)

式中:I:菌丝生长抑制率(%);D0:对照组菌落增长直径(mm);Dt:实验组菌落增长直径(mm)。

1.2.5 菌丝生长抑制法的条件研究

1.2.5.1 培养时间的研究 按照1.2.4.2的方法制备含肽平板,多粘菌素B在培养基中的浓度分别为0.17、0.33、0.67、1.00、1.33和1.67 mg/mL,分别将直径(5.80±0.02)mm的两种丝状真菌菌饼接种于含多粘菌素B的平板,以不含多粘菌素B的平板作对照,28 ℃培养,分别于36、48、60和72 h测量菌丝直径,计算EC50值。

1.2.5.2 菌饼大小的研究 利用打孔器制备直径分别为(5.80±0.02)、(8.00±0.02)和(10.00±0.02) mm的两种丝状真菌的菌饼,分别接种至1.2.4.2配制的不同浓度的多粘菌素B平板上,以不含多粘菌素B的平板作对照,28 ℃培养,A.nigerATCC 16404于48 h测量菌丝直径,P.chrysogenumATCC 10106于72 h测量菌丝直径,计算EC50值。

1.3 数据处理

每组实验进行三个平行,数据取其平均值,采用SPSS 18.0软件进行丝状真菌抑制率的统计分析。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽的选择

研究7种抗菌肽对A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的抑制性,结果见表2。由表2可知,多粘菌素B能够抑制这两种指示菌,且抑菌效果好,抑菌圈直径大于15 mm,因此,本研究的抗菌肽选择多粘菌素B。

表2 7种抗菌肽对指示真菌的抑制性Table 2 The antimicrobial activities of 7 kinds of antimicrobial peptides against the indicator fungi

2.2 多粘菌素B抑制丝状真菌测定方法的比较

2.2.1 孢子萌发抑制法 通过比较孢子萌发抑制法与菌丝生长抑制法研究多粘菌素B对A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的抑制作用。研究发现,在孢子萌发抑制法测定中,采用0.5%葡萄糖培养孢子,对照组的孢子萌发率低,约为40%,达不到测定方法中要求的90%以上[35],而添加多粘菌素B的实验组萌发率更低。有报道[18]显示可以采用培养基替代葡萄糖进行孢子萌发,基于此,本研究采用PDB培养基进行真菌孢子萌发的实验。

结果显示,未添加多粘菌素B的对照组其孢子萌发率约为80%,而添加多粘菌素B的实验组的孢子萌发率均低于对照组,其对孢子萌发的抑制率结果见表3,回归性分析见表4。表3显示,随着多粘菌素B浓度的增加,A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的孢子萌发抑制率逐渐增大,对抑制率进行统计分析(表4),2株菌的卡方均偏大,可见实际测定的孢子萌发抑制率与通过方程得到的理论值间差异较大。同时,参照农业部行业标准[35],其在结果调查中要求对照组的孢子萌发率达到90%以上,而本实验未达到相关标准条件。因此,孢子萌发率法不适合评价多粘菌素B对A.nigerATCC 16404和P.chrysogenumATCC 10106的抑制性。

表3 多粘菌素B对指示菌孢子萌发的抑制率Table 3 Inhibition rate of polymyxin B against conidial germination of A.niger and P.chrysogenum strains

表4 多粘菌素B对指示菌孢子萌发抑制作用分析Table 4 Analysis the inhibition of polymyxin B against conidial germination of A.niger and P.chrysogenum strains

2.2.2 菌丝生长抑制法 多粘菌素B对指示菌菌丝生长抑制率的结果见表5。由表5可知,真菌菌丝的生长均受到多粘菌素B的抑制,随着多粘菌素B浓度的增大,对丝状真菌的抑制作用增强,当浓度为1.67 mg/mL时,对2株指示菌的抑制率均在80.00%左右。

表5 多粘菌素B对指示菌菌丝生长的抑制率Table 5 Inhibition rate of polymyxin B against mycelial growth of A.niger and P.chrysogenum strains

根据多粘菌素B浓度对数值及对应的菌丝生长抑制率的几率值进行回归性及卡方分析,结果如表6所示。

表6 多粘菌素B对指示菌菌丝生长抑制作用分析Table 6 Analysis the inhibition of polymyxin B against mycelial growth of A.niger and P.chrysogenum strains

对菌丝生长抑制法的抑制率进行分析,由表6可知,除多粘菌素B对A.nigerATCC 16404的相关系数r较孢子萌发抑制法的偏小外,其他分析结果均与孢子萌发抑制法相差不大或优于孢子萌发抑制法,尤其是其卡方均小于孢子萌发抑制法的数值,说明菌丝生长抑制法测定的数值与通过方程得到的预测值更为接近,而且多粘菌素B对菌丝生长的抑制作用相对孢子萌发作用强,其EC50均小于1.0 mg/mL。可见,菌丝生长抑制法能够较为准确地检测多粘菌素B的抑菌活性。综合考虑,本研究选择菌丝生长抑制法研究多粘菌素B对丝状真菌的活性定量分析。

2.3 A. niger ATCC 16404菌丝生长抑制法的研究

在菌丝生长抑制性研究中,菌饼的大小在一定程度上反映了真菌的数量,而培养时间会影响菌丝的最终状态,因此二者均会影响测定结果的稳定性和精确性,需要严格控制。

2.3.1 培养时间的研究 以平板中多粘菌素B浓度为0.33 mg/mL为例,观察不同培养时间下A.nigerATCC 16404菌丝生长的情况(图1),如图1所示,随着培养时间的延长,菌丝开始生长,逐渐向菌饼四周延伸,随着菌丝的生长,形成的菌落圆且边缘整齐,易于菌落直径的测量。

图1 培养时间对含肽平板上A.niger ATCC 16404菌丝生长的影响

统计不同培养时间下,多粘菌素B对A.nigerATCC 16404菌丝生长抑制率的结果(表7),并进行回归性分析(表8)。

表7 培养时间对A.niger ATCC 16404菌丝生长抑制率的影响Table 7 Effects of culture time on the inhibition rate of mycelial growth of A.niger ATCC 16404

表8 培养时间影响A.niger ATCC 16404菌丝生长抑制作用的分析Table 8 Analysis the inhibition of mycelial growth of A.niger ATCC 16404 in different culture time

由表7可知,多粘菌素B的抑菌能力随着时间的延长,呈现先降低后上升的现象,36 h的抑制率最高,其次是72 h,但是二者的相关系数r偏小、卡方偏大,说明线性回归性下降,且实际测定值与通过方程得到的理论值偏离较大,数据准确性不高,不适合用于抑菌活性的测定(表8)。综合比较48和60 h的分析结果,48 h的线性关系和准确度高,能充分代表此时抗菌肽的抑菌能力,且减少了时间和成本投入,因此本研究选择48 h为最适的培养时间。在此条件下,多粘菌素B对A.nigerATCC 16404的EC50为0.61 mg/mL。

2.3.2 菌饼大小对菌丝生长的影响 不同直径菌饼的A.nigerATCC 16404菌丝生长情况见图2,由图2可以看出,菌丝围绕菌饼均匀扩展,呈现圆形且边缘整齐,测量误差小。

图2 菌饼直径对含肽平板上A.niger ATCC 16404菌丝生长的影响

不同菌饼直径对菌丝生长抑制率的结果见表9,对抑制率进行线性回归分析,分析结果见表10。

表9 菌饼大小对A.niger ATCC 16404菌丝生长抑制率的影响Table 9 Effect of mycelium plug diameter on the inhibition rate of mycelial growth of A.niger ATCC 16404

表10 菌饼大小影响A.niger ATCC 16404菌丝生长抑制作用的分析Table 10 Analysis the inhibition of mycelial growth of A.niger ATCC 16404 with different plug diameter

表9和表10显示,菌饼直径对抑菌率的影响不大,参考卡方与相关系数r可知,接种菌饼直径(8.00±0.02) mm时,线性关系与精确度都是最佳的,因此选择(8.00±0.02) mm直径的菌饼,此时多粘菌素B对A.nigerATCC 16404的EC50是0.68 mg/mL。

2.4 P. chrysogenum ATCC 10106菌丝生长抑制法的研究

2.4.1 培养时间的研究 为进一步验证菌丝生长抑制法的可行性,将多粘菌素B用于另一株丝状真菌P.chrysogenumATCC 10106的抑菌性研究中。研究了多粘菌素B对P.chrysogenumATCC 10106菌丝生长抑制的最适培养时间,其菌丝生长状态见图3,菌丝生长抑制率见表11,统计分析结果见表12。

表11 培养时间对P.chrysogenum ATCC 10106菌丝生长抑制率的影响Table 11 Effect of culture time on the inhibition rate of mycelial growth of P.chrysogenum ATCC 10106

图3 培养时间对含肽平板上P.chrysogenum ATCC 10106菌丝生长的影响

表12 培养时间影响P.chrysogenum ATCC 10106菌丝生长抑制作用的分析Table 12 Analysis the inhibition of mycelial growth of P.chrysogenum ATCC 10106 in different culture time

由图3可知,随着培养时间的延长,P.chrysogenumATCC 10106菌丝开始从菌饼处向含肽的平板上延伸生长,菌丝生长均匀致密,便于直径的测量。由表11的抑制率数据可以看出,抑制率随培养时间先下降后基本稳定,48 h时的抑菌率下降明显,此后随着时间的延长抑制率基本稳定。表12的统计分析显示,36、72 h的卡方小,准确性较高,比较这2个时间下的相关系数r,二者没有明显差异(p<0.05),线性回归性均较好,考虑36 h菌丝生长量较少,易造成测量误差,综合分析,选择72 h为合适的培养时间,此时多粘菌素B对P.chrysogenumATCC 10106的EC50是0.67 mg/mL。

2.4.2 菌饼大小对菌丝生长情况的影响 不同直径的P.chrysogenumATCC 10106菌饼在多粘菌素B平板上的生长情况见图4,生长抑制率结果见表13和表14。

表13 菌饼大小对P.chrysogenum ATCC 10106菌丝生长抑制率的影响Table 13 Effect of mycelium plug diameter on the inhibition rate of mycelial growth of P.chrysogenum ATCC 10106

表14 菌饼大小影响P.chrysogenum ATCC 10106菌丝生长抑制作用的分析Table 14 Analysis the inhibition of mycelial growth of P.chrysogenum ATCC 10106 with different plug diameter

图4 菌饼直径对含肽平板上P.chrysogenumATCC 10106菌丝生长的影响

图4显示,接种菌饼后所形成的菌落较圆且边缘较整齐,测量误差较小。表13表明,随着菌饼直径的不断增大,抑制率逐渐降低;表14表明参考卡方与相关系数r可知,在接种菌饼直径为(5.80±0.02) mm时,线性关系与准确度均是最优的,因此,选择(5.80±0.02) mm直径的菌饼,此时多粘菌素B对P.chrysogenumATCC 10106的EC50是0.45 mg/mL。

3 讨论与结论

在抗菌肽抑制丝状真菌的活力定量测定中,本研究发现菌丝生长抑制法较孢子萌发抑制法更为准确。目前采用菌丝生长抑制法进行抑菌物质活力测定时,常用于分析的抑菌物质多为抗生素[38]、农药杀菌剂[21,37]、中草药提取物[36]、化学防腐剂[39]等,用于抗菌肽活力测定的研究较少,且还未形成相关的定量测定标准或评价方法。在此基础上,本研究进一步建立了菌丝生长抑制法的定量测定条件:多粘菌素B抑制A.nigerATCC 16404检测中,接种(8.00±0.02) mm直径的菌饼于含多粘菌素B的察氏培养基平板,培养48 h,测得多粘菌素B的EC50是0.68 mg/mL;多粘菌素B抑制P.chrysogenumATCC 10106研究中,选择接种的菌饼直径(5.80±0.02)mm,培养时间72 h,此时多粘菌素B的EC50是0.45 mg/mL。本研究通过控制接种量和培养时间,保证了测定方法的精确度与线性回归性;利用2种丝状真菌进行抑菌方法研究,验证了方法的可行性。