牛肉风味肽的研究进展

张宁龙,王文利,刘 源

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海交通大学农业与生物学院,上海 200240)

随着对生物活性肽的深入研究和认识,许多含有功能特性如提供营养、促进健康[1-2]、具有保健活性[3]和呈味特性[4]的短肽被报道。其中,呈味肽是从食品中分离或由氨基酸合成的对食品风味具有一定贡献的分子质量低于5000 u 的寡肽类物质[5]。呈味肽对食品的贡献呈多元化,除提供特征滋味外还可以作为风味前体物质参与美拉德反应[6-7],即扮演特征滋味肽和风味前体肽两种角色[8]。目前已知的呈味肽主要有咸味肽[9-11]、酸味肽[12]、苦味肽[13-14]、甜味肽[15-17]和鲜味肽[18-20]等。在呈味肽家族中,有一种从牛肉木瓜蛋白酶水解液中分离鉴定的呈味八肽——牛肉风味肽,因其具有典型的滋味特征而备受关注。

牛肉风味肽(beefy meaty peptide,BMP),又称美味提升肽(savory taste-enhancing peptide,STEP),1978年Yamasaki和Maekawa首次在牛肉中发现[21-23],现已作为鲜味肽收录在生物活性肽数据库中(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)。BMP具有良好的热和pH稳定性[24-25],且能稳定地存在于脂肪等复杂体系中[22,26],能够满足多样化的食品环境和加工要求,作为食品风味剂的潜力巨大。目前有关BMP的研究,国外主要集中在其呈味特性与结构的关系上,如Tamura等[27]发现BMP的鲜味由N-端碱性氨基酸(Lys-Gly)和中间部分的酸性氨基酸(Asp-Glu-Glu)共同产生;国内则侧重于BMP的生物合成,如构建BMP串联基因并在毕赤酵母中高效表达[28]等方面。目前,BMP的呈味机制还不十分清晰,而BMP的滋味特性、生物源性等问题的解决关系到其能否用于食品调味体系。

基于此,本文将阐述BMP的呈味特性、呈味机制和生物合成等方面的研究进展和存在的问题,以期全面解析BMP的特征,为推动其在食品体系中的应用提供一些借鉴和理论指导。

1 BMP的呈味特性

BMP是从牛肉的木瓜蛋白酶水解液中分离得到的“美味”八肽[21],氨基酸序列为Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala,分子质量847.39 u[25],等电点预测值4.1[29]。目前报道的BMP的呈味特性详见表1。

表1 BMP的呈味特性 Table 1 Taste characteristics of BMP

BMP的呈味特性因其所处的体系不同而表现出较大的差异性(表1所示)。例如,Spanier等[30]比较了合成的BMP与谷氨酸钠(monosodium glutamate,MSG)的感官差异,发现BMP较MSG有更好的鲜味口感和更强的风味特性;然而,Van等[25]在合成及商业BMP中均未检出文献报道的特征鲜味和肉味[21,23,27,31];Hau等[32]将商业BMP置于纯水及NaCl或/和MSG体系中也并未产生鲜味或肉味,而以酸味、收敛味、甜味、咸味和苦味为主。存在这些差异的原因可能是:a.BMP鲜味可能由合成过程中的杂质引起,而这些杂质的产生与丝氨酸的副反应、混合酸酐偶联过程中的外消旋化作用或断裂的氨基酸序列有关[25]。然而这一假设与从牛肉中分离的BMP具有鲜味[21]的结论矛盾,因为天然来源的BMP由L-氨基酸组成,并未含有上述人工修饰的类似产物;同时,若商业品与报道的有鲜味的BMP的合成材料相同[31],那么肽的纯度则无法解释滋味的差异性。b.组成肽的氨基酸发生了外消旋化作用,即肽的结构稳定性是导致滋味差异的来源[25]。c.BMP在体系中浓度不同而产生滋味的差异,表1所示,Hau等[32]感官所用浓度均低于前期研究的BMP阈值浓度(1.41 mmol/L)[33];而呈味肽在低于阈值下仅具有滋味增强作用,本身几乎没有或仅含有微弱的风味,高于阈值浓度后才表现出滋味特征[33-34],故在亚阈值浓度下没有表现出鲜味难以说明BMP没有风味特性。此外,有研究证实肽的酸味和鲜味有密切关系[5,35],甚至提出可以把酸味肽看作鲜味肽一部分的结论[5]。例如Roudot-Algaron等[36]发现含有Glu的二肽类组分Glu-Asp、Glu-Ala、Glu-Leu等同时呈现酸味与鲜味的特性。Okumura等人[37]从熟制猪肉中分离到3种酸味肽(Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Glu-Val-His-Glu-Val-Val,Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Glu-Val-His-Glu-Val-Val-Glu和Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Glu-Val-His-Glu-Val-His-Glu-Glu-[Val-His)能够增强鲜味和咸味。BMP有六种解离形式,在低pH下,BMP上的三个羧基可解离出微弱的H+使其呈现轻微酸味,当用NaOH调节pH到9.5时,Na+和羧基发生静电作用而产生咸味[38]。总之,BMP所处体系不同,滋味存在差异,目前尚无具体指定的呈味特性。

2 BMP的呈味机制

BMP在水溶液中呈现的多种味感如鲜味、微弱的甜味和酸味是由于其自身结构与味觉受体相互作用的结果。一方面,BMP是由八种氨基酸组成的寡肽,其氨基酸组成、一级结构是呈味的基础;同时其结构具有一定的特异性,在口腔中可与不同的味觉感受器结合,从而使人感受到不同的滋味特性。

2.1 BMP结构和呈味的关系

组成BMP的8个氨基酸(Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala)分别由N-端碱性氨基酸(Lys-Gly),中间部位酸性氨基酸(Asp-Glu-Glu)和C-端疏水性氨基酸(Ser-Leu-Ala)组成,其中Lys-Gly呈现咸味和微鲜味,Asp-Glu-Glu表现出酸味,而Ser-Leu-Ala为苦味(表2所示)。Yamasaki等[31]认为,位于BMP C-端附近的苦味可能在酸性氨基酸向N-端延伸时减弱;另一方面,在这种延伸下,酸味变得强烈,而N端的Lys-Gly的调节使其酸味变得柔和;在整个延伸过程中,BMP的涩味全部消失,整体呈现出肉的可口滋味。关于BMP的结构和呈味的关系,日本广岛大学曾进行系统探究。首先Tamura等[27]研究BMP的一级结构(构成BMP的二肽和三肽,表2所示)和滋味的关系时发现BMP的鲜味由N-端碱性氨基酸和中间部位的酸性氨基酸共同产生。Kuramitsu等[40]进一步指出BMP的滋味由N-端碱性氨基酸和中间部位的酸性氨基酸共同形成,而酸性氨基酸明显影响BMP的滋味(表2)。此后,Nakata等[39]重新合成BMP及其类似物(表3所示),发现类似物和BMP具有相似的鲜味,再次证实上述观点的同时提出一级结构和空间结构并不影响BMP类似物的鲜味或咸味。此外研究发现在BMP的钠盐溶液中,Na+位于N-末端碱性部位、Cl-位于紧邻Na+的中间酸味部位是产生鲜味/咸味的关键[27,39]。

表2 BMP及其片段混合物的滋味Table 2 Taste of BMP and its fragment mixtures

表3 BMP的类似物在pH=6的盐溶液的滋味特性Table 3 Taste behavior of BMP analogs neutralized at original pH levels up to 6

综上,BMP呈现鲜味是其N-端碱性氨基酸(Lys-Gly)和中间部位酸性氨基酸(Asp-Glu-Glu)共同作用的结果,且酸性氨基酸起主要作用;而在BMP的盐溶液中,离子摄入量和所处位置会影响其滋味特性和强度。

另一方面,BMP的结构与目前为止在食品源中发现的数十条呈鲜味短肽[19,41]的分子特性具有很好的一致性:a.分子量介于150～3000 u[42-43],其中低于1000 u的鲜味最强[37,44-45];b.氨基酸组成一般都含有Glu和Asp酸性氨基酸残基中的一种或两种[35,42,44,46],或者含有一定的亲水性氨基酸残基Tyr、Gly、Thr、Phe等[47-48];c.分子组成中同时含有带正电基团(碱性氨基酸)、负电基团(酸性氨基酸)以及疏水基团[49],且正电基团位于负电基团的N-端时才能产生鲜味[50],同时N-端氨基酸为Glu时鲜味更强[45,51]。纵观BMP自身结构及上世纪末日本广岛大学关于其结构和呈味关系的探讨,发现均与目前已挖掘的食品源中的鲜味肽三点共性充分吻合,这为BMP呈现鲜味特征提供有力的分子基础。

2.2 BMP与不同味觉受体的相互作用

BMP会产生微弱甜味,Cagan[52]发现BMP和甜味蛋白monellin亚基Ⅰ的4～10个氨基酸部位相似(甜蛋白4、5、7、10位和BMP 1、2、4、7位的氨基酸一致,图1所示),而Spanier[26]和Shim等[53]也发现鲜味与甜味具有类似的味觉受体。因此,人感知到BMP的微弱甜味可能来源于其和味觉感受器细胞的monellin结合位点相互作用所致[52]。

图1 BMP和甜蛋白结构相似的区域[52]

BMP在纯水中有轻微酸味(表2所示)。研究发现肽组分中酸性或碱性氨基酸残基电离出足够的氢离子可通过酸敏感离子通道(Acid-sensing ion channels,ASIC)进入味蕾细胞,从而使人感受到肽的酸味[54];通常电离出的阳离子H+为定味基,电离出的阴离子A-为助味基。BMP有六种解离形式,在低pH下,BMP上的三个羧基解离出的微弱H+可刺激口腔酸味受体,从而感受到轻微的酸味。

鲜味作为第五种基本味道被普遍接受主要是鲜味受体的发现[19]。研究认为[55-57],鲜味物质分子必须有带正电分子团(AX),带负电分子团(B)和疏水性分子团(X),三种分子团分别接到鲜味受体部位[58](G蛋白偶联受体家族,taste type 1 receptor 1,T1R1和taste type 1 receptor 3,T1R3)才能感受到鲜味。从BMP的氨基酸残基来看,N-端碱性氨基酸Lys-Gly可视为AX,中间三个酸性氨基酸Asp-Glu-Glu可视为B,而C-端Ser-Leu-Ala可视为X[33],这三个分子团之间的相互作用及与对应鲜味受体部位的结合,正是BMP具有鲜味的原因[59]。

综上,BMP之所以能够产生特征滋味而被味觉感受器感知到,首先自身结构要满足一定要求;其次,BMP上具有和味觉受体相结合的部位。从上述机制分析也可得知,BMP不止呈现一种或几种滋味,而是多种滋味的复合体,只是在某些特定的环境条件下某种滋味特征占主导地位。

3 BMP的生物合成

3.1 BMP的生物源性

BMP第一次报道于牛肉的蛋白水解物中,但它是否存在于天然牛肉中尚无统一定论。Spanier等[23,26]研究发现牛肉中BMP可能由内源性蛋白酶(主要为组织蛋白酶B或/和L)的作用形成。然而Hau等[32]在天然牛肉提取液中并未检测到任何BMP的存在(<1×10-6mg/Kg的检测限),同时在蛋白质数据库(SwissProt Database)中未检索到BMP或其前体存在于任何蛋白质或肽片段上,这与Spanier等[26]在蛋白质和基因数据库上搜索的结果一致。但目前为止,大多数蛋白质/肽数据库是在分子生物学和相似的研究领域创建的,即它们主要含有某些“生物学感兴趣”但不一定是食品科学感兴趣的化合物。因此“数据库中未找到”的结果并不一定意味着“化合物不存在”[32]。BMP是否天然存在尚待进一步研究证实,但上述分析也可得知,直接从牛肉中获取BMP的可能性极低,多技术合成法是大量生产BMP的必然选择。

3.2 BMP的制备方法

BMP的制备方法包括化学合成法、蛋白酶解法和生物工程法。化学合成法纯度高但成本也高,产品可能存在试剂残留及产量有限等缺陷,研究BMP的滋味特性时大多使用合成品,但用于生产实际的可能性较低。蛋白酶解法是目前生产呈味肽的主要方式,BMP第一次报道是酶解后经多步分离、纯化的产物[21];目前大多数的鲜味肽来源于酶解产物[60],利用商业酶如中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶等作用于蛋白底物,酶解产物经超滤、纳滤、色谱等技术分离纯化后经质谱分析[61-63]。酶解法虽能获得天然来源的肽,但水解过程影响因素较多,获得的产物也多是肽的混合物,分离纯化过程繁琐,获得较高纯度的、数量可观的肽成本高昂。生物工程法是将BMP基因导入到表达载体中特异性的表达并获取目标产物,具有表达特异性强、易于分离和成本低廉等特点,是大量生产BMP的理想方法[33]。

国外BMP的生物合成有专利报道。欧洲专利Lerch等[64]将BMP基因连接到有信号识别肽序列的载体pNS2上,分别在大肠杆菌、酵母中分泌表达。美国专利Bolen等[65]报道将T蛋白(thaumatin)和M蛋白(monellin)修饰后可以产生新的风味蛋白,其中在TII蛋白(T蛋白的一种)中存在一个风味活性区域(19～26位氨基酸序列),该序列被其他肽段代替后,可以呈现出不同的风味特征,当这段序列被BMP取代后,蛋白具有牛肉风味。国内BMP的生物合成研究以天津科技大学王艳萍课题组为主,主要探究BMP串联基因在毕赤酵母[66]、酿酒酵母[67]中重组表达、表达体系的生物学特征及发酵优化、发酵液发生美拉德反应制备牛肉香精等方面[28,68-69]。此外,为解决合成及天然来源的BMP滋味的差异性,张崟等[70-71]将人工构建的BMP基因导入大肠杆菌中成功表达,以期获得天然来源的肽从而探究其呈味特性,目前该工作正在推进中。

尽管BMP生物合成的理论研究已趋于成熟,但目前其合成和使用尚处于实验室阶段。根据其结构相对稳定、在不同体系中表现出多元的滋味特征,可将BMP与MSG等鲜味剂共同添加到食品中以发挥协同增效作用[38],从而降低MSG的使用,符合现代消费者追求健康、营养、绿色的饮食潮流和观念。BMP有望作为一种新型的肽类调味剂具有广阔的应用前景和市场潜力。

4 展望

目前,食品中鲜味肽的研究受到越来越多的重视,而成熟商品化的BMP可以作为更多鲜味肽发掘和呈味特性研究的基础,从而明晰鲜味肽呈鲜的机制,推动其在食品调味体系的应用。遗憾的是BMP首次报道后虽引起学者广泛关注并针对此八肽做了大量探究性工作,但其在呈味特性、呈味机制、生物源性等方面由于自身结构及所处系统不同而没有一致的结论。因此,关于BMP的后续研究除解决上述问题外还可从以下几点入手。第一,虽然BMP与NaCl、MSG有较好的协同呈味作用[38],但同样存在不一致的报道[25,32];而在食品体系中呈味肽一般与其它调味剂一起使用,因此,有必要深入研究BMP与NaCl、MSG、肌苷酸二钠(disodium inosinate,IMP)、鸟苷酸二钠(disodium guanylate,GMP)等常见增味剂的相互作用。第二,基于BMP的稳定性,优化生物合成法从而大量生产用于食品体系的BMP。第三,目前已发掘了许多呈味短肽,尤其是鲜味肽[19,20,62],但关于呈味肽的滋味强度和相对滋味等评价体系尚未建立,因此无法量化和科学的评价目前已发掘的呈味肽的呈味特征,在实际使用时会存在盲目性和行业混乱性等问题,可以尝试以BMP作为呈味肽的典型代表,构建呈味肽的评价体系,具有很好的开拓价值和现实指导意义。