馒头老酵子中酵母菌的分离鉴定及发酵特性分析

党 辉,刘 柳,胡新中,杨 可

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119)

老酵子是我国传统的馒头发酵剂,一般也被称为“老面”、“酵子”、“面肥”等[1],它是一个多种菌的混合体系[2],含有多种能产气和产香物质的微生物,赋予馒头松软的口感和特殊的风味[3],是重要的生物疏松剂和微生物发酵剂[4-5]。20世纪80年代中期即发活性干酵母进入我国市场,由于其活性高、发酵力大、使用量少等优点,被用于馒头的工厂化生产,但是老酵子由于赋予馒头特殊的风味和口感仍然被大多数地区消费者使用[6]。丁长河等[7]研究发现老酵子发酵的馒头咀嚼性、凝聚性及硬度均好于工业化生产的馒头样品,并且其内部结构,外观形状也显著优于工厂化生产的馒头。因此,酵子将来在馒头加工中具有工业酵母不可替代的应用价值。

关于老酵子发酵面团菌种的研究发现,老酵子中的酵母菌种类丰富多样。酿酒酵母是馒头老酵子中主要的酵母菌[8],具有优良的发酵性能。Liu等[9]从中国不同地区收集的15个老酵子中分离出105株酵母菌,经RAPD分析后,鉴定出6种酵母,用这6种酵母单独发酵制作馒头,分析馒头香气特征与差异,研究表明,馒头的香气特征是由酵母菌决定的。因此,研究老酵子中天然优势酵母菌的发酵性能,可为酵子馒头工业化提供理论依据。阿氏丝孢酵母是世界各地发酵酒糖化发酵剂中经常出现的酵母菌之一,其菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高,而这种酶在葡萄酒糖苷类风味前体的水解中起着非常重要的作用。石威[10]在自然发酵豆渣中分离出阿氏丝孢酵母,李良凤[11]在浆水样品中也分离出阿氏丝孢酵母。

对酵子内部酵母菌的分离、鉴定以及发酵特性的分析是进行酵子工程化生产的必要前提[12]。本文通过对三种不同馒头酵子中分离出的三株不同酵母进行鉴定,并以AQ菌株为对照(从安琪酵母中分离)测定了四株菌的生长曲线以及研究其最适生长温度、最适生长pH、面团发酵力、液化力、糖化力和酯化力的差异,来探讨不同酵母菌的生长发酵特性,以期从此角度为工业筛选有效的天然酵母菌提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酵子 陕西省长安县农户家;酵母基因组DNA提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 marker 大连宝生物公司;10×buffer(Mg2+)、PCR引物ITS4、ITS5 北京奥科生物技术公司;0.1%标准葡萄糖溶液、20 g/L可溶性淀粉、1号液体培养液(氯霉素0.1 g,酵母浸粉10.0 g,蛋白胨20.0 g,加蒸馏水900 mL)、安琪酵母 西安晶博生物科技有限公司。

U-3010型紫外可见分光光度计 日本HITICHI公司;A301681型酸度计 上海默西科学仪器有限公司;AB204-N型分析天平 梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;MJ-250型恒温培养箱 上海和羽良电子科技有限公司;SW-CJ-1F型超净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌分离纯化方法 酵母菌的分离纯化采用稀释平板分离法[9],陕西当地干酵子粉置于无菌水中震荡20 min,取上清液进行梯度稀释后均匀涂布于YPD培养基上,并于28 ℃培养48 h。根据菌落特征及镜检确认为酵母菌后,挑取单菌落平板划线进行纯化,将分离出的三株酵母菌分别接种于1号液体培养液中于28 ℃过夜培养。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增及分子测序 酵母菌DNA的提取使用Yeast Gen DNA Kit酵母基因组DNA提取试剂盒,提取的DNA放置-20 ℃保存备用。PCR 的反应体系为:上、下游引物各2 μL,10×buffer(Mg2+)5.0 μL,dNTPs(each 25 mmol/L)1.0 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)1.0 μL,DNA模板1 μL,用无菌去离子水补齐至50 μL。其中,酵母菌的扩增引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[13]。PCR反应程序:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30个循环;72 ℃终延伸7 min。PCR产物送往上海生工生物工程股份有限公司纯化测序,根据供试菌株的序列,在GenBank数据库中分别进行同源序列搜索同时制作系统发育树鉴定。

1.2.3 酵母菌生长曲线的测定 在1号液体培养基中分别接入OD600值约为1.0的三株酵母菌菌液,置于28 ℃的恒温培养震荡器中以转速180 r/min进行培养,以未接种酵母菌的液体培养基为空白对照,每隔2 h测定OD600值[14]。

1.2.4 最适生长温度和pH的测定 在1号液体培养基中分别接入OD600=1.0的三株酵母菌液(自然pH下),置于24、26、28、32、36、40 ℃的恒温培养箱中以转速180 r/min进行培养,24 h后分别测定OD600值。

在1号液体培养基中分别接入三株酵母菌液,分别调pH为3.1、3.6、4.1、4.6、5.1、5.6、6.1,然后在28 ℃恒温培养箱中以180 r/min进行培养,24 h后分别测定OD600值[15]。

1.2.5 酵母菌发酵面团能力测定 将4.0 g的面粉,0.2 mL的酵母菌液,7 mL无菌水加入到20 mL的无菌有刻度试管中,用玻璃棒迅速混匀成面团状,在30 ℃环境中静置培养,从18 h开始记录面团体积[16]。

1.2.6 液化力、糖化力、酯化力测定 根据《QB/T 4257-2011酿酒大曲通用分析方法》[17]对酵母菌糖化力、液化力进行测定。液化力是35 ℃下100 mL酵母菌液1 h液化淀粉的克数,液化力计算公式如下。

式中:Y表示液化力;2%表示可溶性淀粉溶液质量分数;20表示可溶性淀粉溶液使用体积;3表示酵母菌液的稀释倍数;15表示酶液使用量;3600表示时间;t(s)表示反应时间;1000表示换算成mg。

糖化力是5.0 mL酵母菌液1 h转化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克数,糖化力计算公式如下。

式中:X为试样的糖化力,u/mL;V1为滴定空白时,消耗葡萄糖标准溶液的体积,mL;V2为滴定试样时,消耗葡萄糖标准溶液的体积,mL;2.5为每毫升葡萄糖标准溶液中含有葡萄糖的质量,mg;30为糖化混合液(可溶性淀粉溶液加酵母菌液)的总体积,mL;0.25为5 mL酵母菌液相当酵母的质量,g;5为滴定时吸取的糖化液体积,mL。

酯化力是15 mL酵母菌液经过48 h催化乙酸和无水乙醇合成乙酸乙酯的毫克数。用酸降表示其酯化力[18]。

式中:V0表示反应前消耗氢氧化钠的体积(mL);V1表示反应48h后消耗氢氧化钠的体积(mL)。

1.3 数据处理

使用DPS 9.50软件进行差异显著性分析,利用Excel 2016软件进行数据处理和绘图,每个处理组进行三次平行实验。

2 结果与分析

2.1 酵母菌分离鉴定结果及系统发育树构建

酵母菌两侧的内转录间隔区(ITS区)具有明显的种间差异性,因此可以作为区分鉴定酵母菌的依据[19],是目前酵母菌分类鉴定常用的分子生物学方法。对Y-1、Y-2和Y-3的ITS基因片段进行扩增,将测得的ITS区序列通过GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行同源性分析比较得出,菌株Y-1、Y-2和Saccharomycescerevisiae的相似度分别为99%和100%;Y-3与Trichosporonasahii的相似度为100%。

表1 酵子分离菌株ITS区序列相似性分析

Table 1 Analysis of ITS gene sequences of yeast isolates from Jiaozi

菌株编号酵母菌鉴定结果GenBank登录号相似度(%)Y-1Saccharomyces cerevisiaeAM26283199Y-2Saccharomyces cerevisiaeJN837100100Y-3Trichosporon asahiiJX174411100

由图1可知,菌株Y-1与Saccharomyces属的亲缘关系最近,与SaccharomycescerevisiaeAM262831的同源性为99%,菌株Y-2也与Saccharomyces属的亲缘关系最近,与SaccharomycescerevisiaeJN837100的同源性为100%,菌株Y-3与Trichosporon的亲缘关系最近,与TrichosporonasahiiJX174411的同源性为100%。因此,将Y-1与Y-2鉴定为酿酒酵母,Y-3鉴定为阿氏丝孢酵母。

图1 菌株 Y-1、Y-2以及Y-3的系统发育进化树

2.2 酵母菌的生长曲线

如图2所示,三株酵母菌的生长均包括迟缓期、对数期和稳定期,与文献[20]一致。Y-1、Y-2和AQ三株酵母菌菌株的生长趋势大致相同,延迟期都比较短,对数期较长,此时酵母细胞生长速率最大,酶系活跃,代谢旺盛,且酵母细胞抗不良环境的能力最强;20 h后Y-2进入稳定期,此时酵母菌数量达到最高水平,24 h后Y-1进入稳定期,26 h后AQ进入稳定期,但Y-2的OD值比Y-1和AQ大,说明Y-2具有较强的发酵活性;Y-3酵母菌株的生长曲线与Y-1、Y-2和AQ相比差异较大,Y-3的延迟期比较长,这说明酵母细胞适应新环境而合成必需的酶、辅酶或中间代谢产物的时间比较长;对数期比较短,在24 h后进入稳定期且OD值明显低于其他三株菌,说明其繁殖能力较弱。经比较可以看出,Y-1和Y-2符合酿酒酵母延长期短,最终活菌量大的特点,这对于提高生产效率具有十分重要的作用。

图2 酵母菌生长曲线

2.3 最适生长温度和pH的测定

温度是影响酵母生长的重要因素,由图3A可观察到Y-2的OD600值在不同的温度条件下是最高的,其次是Y-1和AQ,最后是Y-3,这与生长曲线研究结果一致;四株酵母菌在不同温度条件的生物量变化趋势大致相同,都呈现先上升后下降的趋势。Y-1的最适生长温度是28 ℃,因为此温度下酵母菌的生物量最大且与其他温度下的OD600值相比差异显著(p<0.05);在28～32 ℃时,Y-2的生物量无明显差异(p>0.05),与其他温度相比,生物量大且差异显著(p<0.05);Y-3在36 ℃时的生物量最大且与其他温度下的OD600值相比差异显著(p<0.05),当温度上升到40 ℃时,生物量下降明显,说明Y-3的耐高温能力较差。随着温度升高,酵母菌生长代谢量减少,这是由于温度过高发生菌体自溶现象导致菌体减少[21]。

培养基的pH会影响酵母原生质膜对离子的渗透作用,进而影响菌体酶生成、酶活、营养物质的吸收、代谢途径等方面[22]。由图3B可知,培养基pH较低时,酵母菌生长能力弱。当pH在5.1～5.6范围内,Y-1生长良好,当pH减小或者增大时都会受到明显抑制(p<0.05);Y-2在pH=5.1时生长情况最佳(p<0.05),当pH为3.1～4.1和5.6～6.1时无显著性变化,但pH为5.6～6.1时的生物量大于pH为3.1～4.1的生物量且差异显著(p<0.05),说明Y-2的耐酸能力弱;Y-3在pH=4.1时生长情况最佳(p<0.05)。此外,王玉霞[23]研究发现,阿氏丝孢酵母在pH=4时,β-葡萄糖苷酶的含量最高,说明此酸度条件下的的阿氏丝孢酵母代谢活性比较高,与本文研究结果基本一致。此外三株酵母在相同pH条件下生长情况均为:Y-2>Y-1>Y-3,这表明Y-2酵母菌数量最大,其次是Y-1,最后是Y-3,说明Y-2菌株生长代谢率最高,与上述生长曲线以及温度对酵母生长影响的研究结果一致。

图3 温度和pH对酵母菌生长的影响

2.4 酵母菌发酵面团能力测定

酵母产气能力能保证面筋蛋白的充分延伸和面团充分膨胀,是影响面团发酵的重要因素。面团发酵是由酵母菌的生命活动维持的,所以酵母菌自身活性是影响产气量的重要因素之一。面团在酵母菌的作用下发酵会发生一系列的化学反应,α-淀粉酶能将淀粉分解为麦芽糖和糊精,从而继续反应生成葡萄糖,在微生物作用下,葡萄糖生成丙酮酸,丙酮酸在酵母菌的作用下继续反应生成乙醛,然后乙醛被还原成乙醇,在一系列的反应中,产生的CO2增加了馒头的体积。构成面团的面筋经发酵后得到充分扩展,使气体能保留在发酵面团内部使面团膨胀,从而赋予馒头松软的口感。

面团膨发体积反映出面团的持气能力,如图4可知,三株酵母在发酵初期进行旺盛的有氧呼吸,发酵速度较快,面团体积速度增大,发酵一段时间后,Y-1与Y-3发酵的面团体积平稳,Y-2在2.5 h后出现塌陷现象,这是由于Y-2发酵面团前期产气速度过快,使得酵母产气量较早达到高峰,而此时面团的持气能力还未达到最高峰,使得面团内部形成高压,当超过面筋的弹性极限时面筋网络断裂,CO2溢出,导致面团体积减小。不同酵母菌对面团的膨发能力是有差异的,这是由酵母菌自身性质决定的。在0～2 h之间,Y-1与Y-3进行缓慢发酵,面团体积逐渐增大到最大值,2 h后处于平稳状态(p>0.05);Y-2在发酵初期产气速度快,产气量大,1 h后进入平稳期(p>0.05),但2 h后溢出的CO2量较多,持气量较其他两株酵母菌稍差;Y-1和Y-3酵母产气能力较弱,但持气能力比较强;2和2.5 h时Y-2发酵面团的体积最大且。综合比较Y-2的面团发酵能力最好,其次是Y-3,最后是Y-1。

图4 酵母菌发酵面团能力测定结果

2.5 酵母菌液化力、糖化力、酯化力测定

酵母菌的糖化力、液化力、酯化力是评价酵母菌质量的重要指标[24],这些能力指的是酵子中具有液化作用、糖化作用、酯化作用的酶及微生物能将淀粉转化为糖分的程度[25-26]。液化力反映了酵母菌将淀粉水解为糊精的能力,这也是淀粉水解最后生成葡萄糖被人体吸收利用的重要步骤。由图5A可以看Y-2液化能力最强,与其他两株酵母菌相比差异显著(p<0.05),Y-1与Y-3差异不明显(p>0.05)。糖化力是酵母代谢产生的糖化酶催化淀粉转化成糖,因此糖化酶是糖化力的主要影响因素,由图5B可以看出Y-2的糖化能力最强,与其他两株酵母菌相比差异显著(p<0.05),Y-1的糖化能力稍强于Y-3,但差异不明显(p>0.05)。酯化力是酵母菌催化合成酯类的能力,对发酵面团形成独特的风味有重要的贡献,由图5C可知,Y-2的酯化力最强,与其他两株酵母菌相比差异显著(p<0.05),Y-1的酯化能力稍强于Y-3,但差异不明显(p>0.05),这与糖化力结果是一致的。液化力、糖化力与酯化力的结果与酵母菌生长曲线有一定的相关性,酵母菌繁殖能力越强,产生的酶越多。Y-1与Y-2都是酿酒酵母,它们的繁殖能力比Y-3强,所以在液化力、糖化力以及酯化力方面Y-1与Y-2较Y-3有优势。

图5 三株酵母菌的液化力、糖化力、酯化力测定结果

3 结论

通过对从老酵子中分离出的三株酵母菌进行测序以及一些发酵性能的测定,得到以下结论:三株酵母菌中两株(Y-1和Y-2)为酿酒酵母,另一株(Y-3)为阿氏丝孢酵母,阿氏丝孢酵母是首次在老酵子中被分离出来。Y-1与Y-2这两株酿酒酵母的生长能力比Y-3阿氏丝孢酵母能力强;Y-1的最适生长温度是28 ℃,Y-2的最适生长温度是28～32 ℃,Y-3的最适生长温度是36 ℃;Y-1最适生长pH为5.1～5.6,Y-2最适生长pH为5.1,Y-3最适生长pH为4.1;面团发酵能力和液化力、糖化力、酯化力都是Y-2>Y-1>Y-3。研究结果可以反映在馒头酵子发酵过程中酵母菌的多样性,为进一步研究具有我国西北部地区特色发酵面食风味特征、筛选优良天然酵母提供参考。