虾蛄肌原纤维蛋白磷酸化工艺及其在虾蛄肉制品中的应用

尚 坤,陈金玉,张坤生,任云霞,张 典,吴 鹏

(天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津市食品生物技术重点实验室,天津 300134)

虾蛄(Mantis shrimp),又称为皮皮虾、虾爬子、螳螂虾等,在我国各沿海地区分布广泛,以黄海、渤海产量最大[1]。虾蛄营养价值极高,除富含蛋白质外,还含有大量的磷、钙、镁等微量元素,其药用价值也非常可观[2-4]。肌原纤维蛋白(Myofibrillar protein,MP)是组成肌肉中肌原纤维的蛋白质,是一类具有重要生物学功能的盐溶性蛋白,主要由肌球蛋白、肌动蛋白和少量调节性结构蛋白等组成的蛋白质群,其结构和性质与肉制品的嫩度、口感及弹性、保水性等密切相关[5-6]。

大量研究表明,磷酸化可以有效改善蛋白质的功能特性[7-9],常见的磷酸化试剂有三聚磷酸钠(STP)、三偏磷酸钠(STMP)、三氯氧磷(POCl3)、焦磷酸钠(SPP)等,其中STP和STMP是FDA允许的食品添加剂[10]。磷酸盐通过提供无机磷和蛋白质基团特定氨基酸分子的氧原子或氮原子发生酯化反应,但不同的磷酸盐与蛋白质反应的部位、反应途径、反应产物等也会有所不同[11]。Xiong等[12]研究表明多聚磷酸盐可引起肌原纤维蛋白结构的变化,且不同磷酸盐对蛋白质溶解度也存在差异,说明磷酸盐的种类会影响蛋白质的性质。目前关于单一磷酸盐对虾蛄肌原纤维蛋白磷酸化修饰并探究其性质的研究较多[13-15],但采用STP、SPP、STMP三种不同的多聚磷酸盐分别对肌原纤维蛋白进行磷酸化改性,并以复合磷酸盐的形式加入虾蛄肉制品中的研究尚未见报道。

本文分别采用STP、SPP、STMP对虾蛄肌原纤维蛋白进行磷酸化修饰,研究单一磷酸盐在不同反应pH、磷酸盐添加量、反应时间条件下对磷酸化程度的影响,利用响应面法对虾蛄肌原纤维蛋白磷酸化的工艺条件进行系统优化,探究最佳工艺条件及复合磷酸盐对新型果蔬虾饼品质的影响,旨在为多聚磷酸盐在水产品中的应用研究,以及为提高虾蛄的营养价值和商业价值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜活的虾蛄 购于天津市南开区王顶堤批发市场,-80 ℃冷藏,实验前取出,在4 ℃条件下解冻;新鲜胡萝卜、山药、柠檬 购于天津市华润万家超市。牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA) 美国Sigma公司;三聚磷酸钠 天津市光复精细化工研究所;焦磷酸钠 天津市福晨化学试剂厂;三偏磷酸钠 上海源叶生物科技有限公司;其它试剂均为分析纯；胡椒粉、玉米淀粉、卡拉胶、食盐、白糖、鸡蛋、料酒、抗坏血酸 购于天津市华润万家超市，以上均为食品级。

AvantiJ-E高效离心机 美国BECKMAN COULTER公司;IKA T10高速组织匀浆机 德国IKA公司;EL20实验室pH计 梅特勒—托利多仪器有限公司;EMS-9A加热磁力搅拌器 天津欧诺仪器仪表有限公司;U-5100比例双光束分光光度计 日立高新技术公司;TA.XT plus物性测试仪 英国Stable Micro Systems公司;Hunter Lab色差仪 美国Hunter Lab公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肌原纤维蛋白的提取 参照袁程程等[16]的方法。将-80 ℃冻藏的虾蛄在4 ℃条件下解冻24 h。将虾蛄去头、尾,剔除虾线、外壳,取肉,并揉捏至糜状后称重,加入4倍体积的蛋白提取液(0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA-2Na、0.1 mol/L NaH2PO4/Na2HPO4,pH=7),高速匀浆30 s,在4 ℃、5000 r/min的高速冷冻离心机离心15 min后,留沉淀,重复上述操作3次,即得粗蛋白。将粗蛋白称重,再加入4倍体积0.1 mol/L NaCl,高速匀浆30 s,重复上述3次,留沉淀,即得肌原纤维蛋白。

1.2.2 磷酸化肌原纤维蛋白的制备 参照王诗萌等[13]的方法并加以改进。按照单因素实验设计,将1.2.1提取的肌原纤维蛋白浓度调整至质量浓度为2%,加入一定量的STP、SPP、STMP,在10000 r/min下匀浆20 s,以0.1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液调节到一定的pH,并在室温下用磁力搅拌器搅拌反应一定时间。反应结束后在4 ℃条件下透析24 h,即得磷酸化肌原纤维蛋白。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 反应pH对磷酸化程度的影响 STP、SPP、STMP添加量均为2%,反应时间均为2 h,反应pH均为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0[15],考察反应pH对虾蛄肌原纤维蛋白磷酸化程度的影响。

1.2.3.2 磷酸盐添加量对磷酸化程度的影响 STP、SPP、STMP样品组反应pH分别为8.0、7.5、8.0,反应时间均为2 h,STP、SPP、STMP添加量均为1%、2%、3%、4%、5%,考察磷酸盐添加量对虾蛄肌原纤维蛋白磷酸化程度的影响。

1.2.3.3 反应时间对磷酸化程度的影响 STP、SPP、STMP样品组反应pH分别为8.0、7.5、8.0,STP、SPP、STMP添加量分别为4%、2%、4%,反应时间均为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,考察反应时间对虾蛄肌原纤维蛋白磷酸化程度的影响。

1.2.4 响应面优化实验 为了分析三个因素间的交互作用,使磷酸盐对肌原纤维蛋白的磷酸化程度达到最佳。在单因素实验基础上,设计STP、SPP、STMP响应面实验因素水平表见表1～表3。选取反应pH、磷酸盐添加量、反应时间共3个对磷酸化工艺影响显著的因子,进行三因素三水平组合实验。

表1 STP响应面实验因素水平Table 1 Factors and levels of STP response surface experiment

表2 SPP响应面实验因素水平Table 2 Factors and levels of SPP response surface experiment

表3 STMP响应面实验因素水平Table 3 Factors and levels of STMP response surface experiment

1.2.5 蛋白质标准曲线与磷酸根标准曲线 采用双缩脲法[17]和钼蓝比色法[18]分别进行标准曲线绘制。以X为蛋白质质量(mg),Y为吸光度值,得到蛋白质标准曲线方程:Y=0.0478X+0.0067,R2=0.9998;以X为磷酸根标准液质量浓度,Y为吸光度值,得到磷酸根标准方程:Y=7.1734X+0.023,R2=0.9997。由于R2值非常接近于1,表明两者分别与吸光度的线性关系较好。

1.2.6 蛋白质质量浓度和磷酸化程度的测定 根据1.2.5方法测定蛋白浓度。每个样品做3次平行,取平均值,得到肌原纤维蛋白质量浓度为5.45%。将1.2.2的蛋白溶液,均等分成两份,其中一份按1.2.5方法直接测定磷酸根的含量;另一份蛋白溶液中加入等体积10%三氯乙酸,在4 ℃、3000 r/min离心10 min,留上清液,测定上清液中磷酸根含量。按公式(1)计算肌原纤维蛋白的含磷酸根量。磷酸化程度用每克蛋白含磷酸根量表示。

含磷酸根量(mg/g)=[总磷酸根量(mg)-上清液磷酸根量(mg)]/肌原纤维蛋白质量(g)

式(1)

1.2.7 新型果蔬虾饼的制备 新鲜的胡萝卜和山药分别洗净,去皮切段,蒸30 min,待冷却后斩拌成泥,备用;柠檬取汁,现取现用;取1.2.1中处理好的虾蛄肉称重,以虾肉质量为基准,加入0.3%[19]的不同比例复合磷酸盐(经实验确定STP∶SPP∶STMP的比例为2∶1∶2,在此基础上设计4组不同比例的复合磷酸盐,分别为对照组、1∶1∶1、1∶2∶2、2∶2∶1)、2%食盐、8%料酒混合均匀后在4 ℃条件下腌制2 h(根据响应面结果和实际可操作性,未调节pH),再加入15%胡萝卜泥、10%山药泥、1.5%柠檬汁、0.8%胡椒粉、3%卡拉胶、20%玉米淀粉、2%白糖、3%蛋清、0.02%抗坏血酸,斩拌成糜状后,均匀地铺在直径为15 cm圆盘上,厚度为2 cm,并用保鲜膜密封,放入蒸锅中蒸20 min后,冷却。

1.2.8 新型果蔬虾饼相关指标的测定

1.2.8.1 蒸煮损失的测定 根据公式(2),计算虾饼的蒸煮损失。式中m1为蒸前质量,m2为蒸后质量。

式(2)

1.2.8.2 抗坏血酸含量的测定 依据GB 5009.86-2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》[20]中的2,6-二氯靛酚法测定蒸后的虾饼中抗坏血酸的含量。

1.2.8.3 质构的测定 将1.2.7中蒸后的虾饼切成4 cm×4 cm×2 cm的块状用于质构性质测定。质构分析探头类型:P 50,测试参数:测前速率为2.00 mm/s,测试速率为2.00 mm/s,测后速率为1.00 mm/s,压缩比为50%[21]。测定硬度、弹性、回复性、黏聚性和咀嚼度5个指标,每组测定3次,取平均值。

1.2.8.4 色差的测定 将1.2.7中蒸后的虾饼切成3 cm×3 cm×2 cm的块状用于色差的测定。采用全自动色差测定仪对L*、a*、b*测定[22],其中L*表示亮度值,a*表示颜色的红度值,b*表示颜色的黄度值,每组样品做3 次平行,取平均值。

1.3 数据处理

通过Design Expert 8.0软件设计响应面分析,采用Excel 2007、Origin 9.0进行绘图,并通过SPSS 16.0对实验数据进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 反应pH对磷酸化程度的影响 由图1可知,随着pH的增大,STP、SPP和STMP作用下的虾蛄肌原纤维蛋白磷酸化程度均呈先上升后下降的趋势。当反应pH为8.0时,STP和STMP磷酸化程度最大;当反应pH为7.5时,SPP磷酸化效果最好。这可能是由于磷酸盐在较低pH下不稳定,易分解形成活性较低的物质[23],不利于磷酸化的进行。随着pH增加,蛋白氨基酸侧链的活性基团氨基和羧基活性逐渐增强,因此有利于蛋白质与磷酸根的结合,研究表明STP、SPP和STMP可分别与赖氨酸、丝氨酸和酪氨酸、丝氨酸等氨基酸残基发生共价结合[24]。pH过高,蛋白质易发生变性,从而降低了与磷酸根的结合能力,使磷酸化程度下降。三种磷酸盐的活性不同,与蛋白质结合能力不同,其磷酸化程度也有所不同。因此,选择8.0作为STP和STMP最适反应pH,选择7.5作为SPP最适反应pH。

图1 反应pH对磷酸化程度的影响

2.1.2 磷酸盐添加量对磷酸化程度的影响 由图2可知,随着磷酸盐添加量的增加,肌原纤维蛋白的磷酸化程度均呈先增大后降低的趋势,其原因可能是,随着磷酸盐的添加,磷酸根不断与蛋白质特定位点上的氨基酸残基结合,从而提高磷酸化程度;当二者的共价结合反应达到饱和时,磷酸化程度达到最大值;继续增加磷酸盐,蛋白质之间静电斥力加大,阻碍磷酸根与氨基酸残基结合,从而导致磷酸化程度降低[25]。当STP、STMP的添加量为4%,磷酸化程度达到最大,与周景丽等[15]采用STP磷酸化虾蛄盐溶蛋白的结论一致。当SPP的添加量为2%,磷酸化程度达到最大。因此,可确定STP和STMP最佳添加量均为4%,SPP最佳添加量为2%。

图2 磷酸盐添加量对磷酸化程度的影响

2.1.3 反应时间对磷酸化程度的影响 由图3可知,随着时间的延长,三种磷酸盐对虾蛄肌原纤维蛋白的磷酸化程度均呈先增大后降低的趋势,当STP、SPP反应时间为2.0 h,其磷酸化程度达到最大;当STMP反应时间为2.5 h,其磷酸化程度达到最大。其原因可能是,随着反应时间延长,磷酸根能充分地与氨基酸残基结合,磷酸化程度逐渐增加;但反应时间过长,可能会导致蛋白质变性,从而使磷酸化程度下降。因此,选择2.0 h为STP、SPP最佳反应时间,选择2.5 h为STMP最佳反应时间。

图3 反应时间对磷酸化程度的影响

2.2 响应面优化磷酸化虾蛄肌原纤维蛋白

2.2.1 建立回归模型 采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计,根据Box-Behnken原理,选取反应pH、磷酸盐添加量及反应时间为自变量,以磷酸化程度为响应值,设计三因素三水平的响应面分析实验,见表4。每组样品做3次平行,取平均值。

表4 响应面实验设计与结果Table 4 Design and results of response surface experiment

表5 响应面方差分析结果Table 5 Analysis results of response surface variance

2.2.2.1 两因子间交互作用分析 图4～图6表示由反应pH、STP添加量、反应时间三个因素交互作用下得到的响应值构成的三维空间曲面。图4可知,虾蛄肌原纤维蛋白的磷酸化程度随反应pH和STP添加量的增加呈先增加后降低的趋势,反应pH对磷酸化程度的曲线较为陡峭,说明反应pH对磷酸化程度的影响小于STP添加量。图5可知,随反应pH增加和反应时间的延长,虾蛄肌原纤维蛋白的磷酸化程度呈先增大后减小。根据其等高线呈圆形可知反应pH与反应时间的交互作用不显著。图6可知,磷酸化程度随STP添加量的增加先增大后减小,随反应时间的延长先增大后趋于平缓。根据其等高线呈椭圆形可知STP添加量与反应时间的交互作用显著,说明两者协同可改善磷酸化程度。

图4 反应pH和STP添加量的响应面分析图

图5 反应pH和反应时间的响应面分析图

图6 STP添加量和反应时间的响应面分析图

2.2.2.2 最佳条件的预测及验证实验 通过回归模型的预测,得到STP磷酸化虾蛄肌原纤维蛋白的最佳工艺参数为:反应pH8.02,STP添加量4.27%,反应时间1.98 h,此时磷酸化程度的理论值最大为101.47 mg/g。结合实际生产,将各因素进行调整为:反应pH为8.0,STP添加量为4%,反应时间为2.0 h。在此条件下进行3次平行验证实验,得到磷酸化程度的平均值为102.87 mg/g,仅有1.38%误差,证实了该模型的有效性。

2.2.3 SPP磷酸化模型分析 由表6可知,回归模型极显著(p<0.0001),失拟项p=0.2139>0.05不显著,R2=0.9858,RAdj=0.9676,说明该模型拟合度较好。方差分析结果表明,B、C、A2、B2和C2为极显著项(p<0.01),A、AB、AC和BC项差异不显著(p>0.05)。由方差分析结果可知,3个因素对磷酸化程度的影响主次顺序为:B(SPP添加量)>C(反应时间)>A(反应pH)。

表6 响应面方差分析结果Table 6 Analysis results of response surface variance

2.2.3.1 两因子间交互作用分析 图7～图9表示由反应pH、SPP添加量、反应时间三个因素交互作用下得到的响应值构成的三维空间曲面。由图7可知,虾蛄肌原纤维蛋白的磷酸化程度随反应pH的增大先增加后降低,随着SPP添加量的增加先平缓上升后下降。由图8可知,虾蛄肌原纤维蛋白的磷酸化程度随反应pH和反应时间的增加均呈先增加后降低的趋势。由图9可知,虾蛄肌原纤维蛋白的磷酸化程度随SPP添加量和反应时间的增加均先增大后减小,其响应面的坡度非常陡峭,表明磷酸化程度对于SPP添加量和反应时间的改变非常敏感。

图7 反应pH和SPP添加量的响应面分析图

图8 反应pH和反应时间的响应面分析图

图9 SPP添加量和反应时间的响应面分析图

2.2.3.2 最佳条件的预测及验证实验 为验证响应面实验的可靠性,对响应面得到的最佳工艺参数:反应pH7.48,SPP添加量2.28%,反应时间2.08 h进行验证。考虑到实验的实际可操作性,将工艺参数中的反应pH修正为7.5,SPP添加量为2%,反应时间为2.0 h,所得磷酸化程度的平均值为96.41 mg/g,与预测值96.07 mg/g相比,误差仅为0.66%,说明采用响应面法优化肌原纤维蛋白磷酸化工艺条件是可行的。

2.2.4 STMP磷酸化模型分析 由表7可知,回归模型极显著(p<0.0001),失拟项不显著(p=0.2626>0.05),R2=0.9827,RAdj=0.9604,说明模型可用于实际值的预测,实验方法可靠。由表7的方差分析表明,因素C对磷酸化程度的影响显著(p<0.05),因素A、B、A2、B2、C2对磷酸化程度的影响极显著(p<0.01),因素AB、AC、BC对磷酸化程度的影响不显著(p>0.05)。由方差分析结果表明,各因素对磷酸化程度影响的主次顺序:B(STMP添加量)>A(反应pH)>C(反应时间)。

表7 响应面方差分析结果Table 7 Analysis results of response surface variance

2.2.4.1 两因子间交互作用分析 图10～图12表示由反应pH、STMP添加量、反应时间三个因素交互作用下得到的响应值构成的三维空间曲面。由图10可知,虾蛄肌原纤维蛋白的磷酸化程度随反应pH增大先增加后降低,随STMP添加量的增加先平缓增加后降低,其响应面坡度相对平缓,表明STMP添加量对磷酸化程度的影响较小。由图11可知,虾蛄肌原纤维蛋白的磷酸化程度随反应pH和反应时间的增加均先增加后降低。由图12可知,虾蛄肌原纤维蛋白的磷酸化程度随STMP添加量和反应时间的增加均先增大后减小。

图10 反应pH和STMP添加量的响应面分析图

图11 反应pH和反应时间的响应面分析图

图12 STMP添加量和反应时间的响应面分析

2.2.4.2 最佳条件的预测及验证实验 通过响应面实验得到最佳的磷酸化条件,即反应pH8.05,STMP添加量4.42%,反应时间2.55 h,其磷酸化程度可达到77.68 mg/g。根据实验的实际可操作性,选择反应pH为8.0,STMP添加量为4%,反应时间为2.5 h,所得磷酸化程度的平均值为76.53 mg/g,误差为1.48%,说明响应面优化法能够很好地拟合肌原纤维蛋白磷酸化条件与磷酸化程度之间的关系。

2.3 复合磷酸盐对新型果蔬虾饼品质的影响

2.3.1 不同比例复合磷酸盐对蒸煮损失和抗坏血酸含量的影响 由图13可知,对照组的蒸煮损失明显高于其他处理组(p<0.05),与Keenana等[26]结论一致。可能是由于磷酸盐的添加增加了肌原纤维蛋白之间的静电斥力,使蛋白质多肽展开促进水合作用及各化学键的形成,此外蛋白交联形成的三维网状结构可以锁住更多的水分,减少水分流失,因而蒸煮损失较低;当复合磷酸盐比例为2∶1∶2时,蒸煮损失最低。对照组的抗坏血酸量显著低于其他处理组(p<0.05),添加的复合磷酸盐比例为2∶1∶2时,虾饼的抗坏血酸量最高。抗坏血酸在高温下极不稳定,易受到某些金属离子的影响,磷酸盐具有金属离子螯合能力,使得Mg2+、Ca2+等离子无法参与氧化反应,从而抑制抗坏血酸的分解,提高其稳定性[27]。

图13 不同比例复合磷酸盐对虾饼蒸煮损失和抗坏血酸量的影响

表8 不同比例复合磷酸盐对虾饼质构的影响Table 8 Effect of different proportions of compound phosphate on texture properties of shrimp pies

2.3.2 不同比例复合磷酸盐对质构的影响 由表8可知,硬度方面,加入磷酸盐的处理组均显著(p<0.05)高于未加磷酸盐的对照组,比例为1∶1∶1组除外,当复合磷酸盐的比例为2∶1∶2时，硬度达到最大;弹性方面,5组之间差异不显著(p>0.05),但加入磷酸盐后,虾饼弹性均有提高,且复合磷酸盐的比例为2∶1∶2时弹性达到最大;回复性方面,加入磷酸盐的处理组与对照组之间差异显著(p<0.05),当复合磷酸盐的比例为2∶1∶2时，回复性达到最小;粘聚性方面,加入磷酸盐处理组的粘聚性均低于对照组，但差异不显著(p>0.05);咀嚼度方面,加入磷酸盐处理组的咀嚼度显著高于对照组(p<0.05),比例为1∶1∶1组除外，当复合磷酸盐比例为2∶1∶2时，咀嚼度达到最大。综合来看,磷酸盐的加入能显著提高虾饼的质构特性,其原因是磷酸盐的加入改变体系的pH及离子强度,使大分子的电荷分布发生变化,有利于形成稳定的网络结构,且磷酸盐能将肌原纤维蛋白解离成单体,增加亲水基团从而使蛋白质溶解度增大,有利于蛋白质分子间的相互作用和交联,从而改善虾饼的品质[28];对比4组磷酸盐处理组,最优复合磷酸盐比例为2∶1∶2。

2.3.3 不同比例复合磷酸盐对色差的影响 色差的评定在肉制品中占重要地位,直接影响到产品质量的好坏及消费者的购买力。由图14可知,L*值方面,添加1∶1∶1复合磷酸盐处理组与对照组、其他处理组之间均有显著差异(p<0.05);a*方面,添加2∶2∶1复合磷酸盐处理组与对照组之间有显著差异(p<0.05),与其他处理组均无显著差异,可能是由于磷酸盐破坏了蛋白质的结构,从而影响虾饼的光学性质,改变了虾饼的透光率和折光性,红度值略有变化;b*方面,5组均无显著变化(p>0.05)。综合来看,复合磷酸盐对虾饼色差的影响不大。

图14 不同比例复合磷酸盐对虾饼色差的影响

3 结论

不同磷酸盐对虾蛄肌原纤维蛋白进行磷酸化改性时,其最佳工艺条件有所差异。通过响应面实验得到STP磷酸化虾蛄肌原纤维蛋白的最佳工艺参数:反应pH为8.0,STP添加量为4%,反应时间为2.0 h,在此条件下磷酸化程度为102.87 mg/g,与理论预测值仅有1.38%误差;SPP磷酸化虾蛄肌原纤维蛋白的最佳工艺参数:反应pH为7.5,SPP添加量为2%,反应时间为2.0 h,所得肌原纤维蛋白磷酸化程度为96.41 mg/g,误差仅为0.66%;STMP磷酸化虾蛄肌原纤维蛋白的最佳工艺参数:pH为8.0,STMP添加量为4%,反应时间为2.5 h,在此条件下所得磷酸化程度为76.53 mg/g,与预测值误差为1.48%,所得模型具有较好的拟合度,优化结果可靠。在此基础上,将三种磷酸盐以不同的复合比例应用到虾蛄制品中,探究磷酸盐对实际加工肉制品品质的影响,结果表明:复合磷酸盐可显著降低虾饼的蒸煮损失和在加工过程中抗坏血酸含量的损失(p<0.05),并提高其质构特性,但对色差影响不大;当STP∶SPP∶STMP比例为2∶1∶2时,虾饼品质最好。