红心火龙果柚子复合果醋发酵工艺条件优化

熊亚，李敏杰*

(1.攀枝花学院 生物与化学工程学院，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花市 干热河谷特色生物资源工程技术中心，四川 攀枝花 617000)

与粮食醋相比，果醋的营养成分更为丰富，且口味醇厚、风味浓郁、新鲜爽口、功效独特。果醋因其良好的饮用风味与营养保健功能，已受到越来越多消费者的欢迎，人们对果醋的营养、口感、风味的要求日益俱增[1-3]。目前虽然果醋的品种开始增多，也不断有各种复合醋研制的报道[4-6]，但果醋市场的品种及口味还比较单一，复合型醋饮料及调味品仍具有很大的市场潜力。

红心火龙果和柚子都是很好的食用资源，火龙果除了是一种高纤维、低脂肪、低糖度的水果外，还含有碳水化合物、粗纤维、不饱和脂肪酸、抗氧化物、VC和花青素等，甚至还含有其他植物少有的植物性蛋白，对人体重金属中毒具有解毒的功效[7]。柚子含多种糖类、有机酸、维生素和各种无机盐，对人体十分有益[8]，柚子果肉及皮含有生物活性物质生物苷[9]，可以降低血液粘稠度，对脑血管疾病如脑血栓、脑卒等有较好的预防作用[10]。目前对它们的利用主要集中在果汁饮料、果酒、单一果醋的发酵方面[11-16]，对红心火龙果柚子复合醋的研制尚未见相关报道。本试验采用响应面法，对红心火龙果柚子复合醋的发酵工艺进行了优化，以期为开发复合醋市场潜力、综合资源利用等提供一定的理论和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

坪山柚、红心火龙果：购于沃尔玛超市；酵母(安琪高活性酵母)：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；果醋菌：烟台帝伯仕自酿有限公司；果胶酶(3×105U/g)：江苏锐阳生物科技有限公司；亚硫酸(99.8%)、柠檬酸(AR)、NaOH(AR)：成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

THZ-C恒温摇床培养箱 江苏省金坛市大地自动化仪器厂；FA2204B型电子天平 上海越平科学仪器有限公司；Q/GHSC型精密pH计 上海森信试验仪器有限公司；WYT-J型手持式糖度仪 成都豪创光电仪器有限公司；D2KW-4型电热恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；0-40型酒精计 国营河北省武强县仪表厂；T2264MD榨汁机 上海九阳股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

红心火龙果、柚子→洗净、去皮、榨汁→以一定比例混合→酶解→过滤→SO2、果胶酶↓滤汁→成分调整↑酵母、白砂糖、柠檬酸→酒精发酵→酒精发酵液→加入醋酸菌→醋酸发酵→杀菌→成品。

1.3.2 操作要点

原料预处理：将红心火龙果和柚子洗干净，去掉果皮，柚子去核，然后将去皮红心火龙果和柚子分别切成大小合适的小块，放入榨汁机破碎榨汁。

SO2、果胶酶的添加：榨汁后加入60 mg/L的二氧化硫以防止杂菌污染，并加入50 mg/L果胶酶酶解1 h以分解果胶，增加出汁率。

成分调整：加入白砂糖调节初始糖度为220 g/L，加入柠檬酸调节酸度为4.5 g/L，加入酵母菌进行酒精发酵。

酒精发酵：按照试验方案调整好后，放置于恒温培养箱(温度按照试验方案进行调整)中发酵8 d。

醋酸发酵：按照试验方案将酒精发酵液放置于恒温摇床(温度按照试验方案进行调整)中进行醋酸发酵，发酵10 d。

1.3.3 酒精发酵单因素试验和正交试验

试验选取温度(22，24，26，28，30 ℃)、酵母菌接种量(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L)、红心火龙果汁与柚子汁的体积混合比例(1∶1、2∶3、3∶7、1∶4、1∶9)进行单因素试验，测定红心火龙果柚子酒的酒精度。根据单因素试验结果，设计三因素三水平的正交试验。以最终产品的酒精度为指标，得出红心火龙果柚子酒的最佳发酵参数。根据正交试验结果，利用正交助手V3.1软件进行方差分析。

1.3.4 醋酸发酵单因素和响应面试验

红心火龙果柚子复合果醋的发酵是在生成红心火龙果柚子复合果酒的基础上，在有氧的条件下，利用果醋菌，将果酒转化为果醋的过程。醋酸含量作为衡量产品质量的标准。由大量资料查得，影响果醋发酵最大的因素分别为发酵温度、初始酒精度和醋酸菌接种量。因此，选取发酵温度(28，30，32，34，36 ℃)、果醋菌接种量(300，400，500，600，700 mg/L)、初始酒精度(4%、6%、8%、10%、12%)来进行单因素试验。在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken设计原理，以初始酒精度(X1)、发酵温度(X2)、醋酸菌接种量(X3)为自变量，以醋酸含量(Y)为响应值，设计三因素三水平的响应面试验，优化发酵工艺。

1.3.5 理化指标的测定

酒精度的测定：采用蒸馏法对果酒的酒精度进行测定；醋酸含量的测定：利用强碱滴定弱酸的中和滴定原理来进行醋酸含量的测定。

2 结果与分析

2.1 酒精发酵单因素和正交试验

2.1.1 不同发酵温度对酒精度的影响

图1 温度对红心火龙果柚子汁酒精度的影响Fig.1 The effect of temperature on alcohol degree of red pitaya and pomelo juice

由图1可知，当温度低于26 ℃时，随着温度升高，酒精度升高；当温度高于26 ℃时，随着温度升高，酒精度降低；当温度为26 ℃时，酒精度最高，为4.2%。这可能是由于温度影响了酵母菌的活性，温度较低时，酵母菌的生长受到抑制；温度较高时，酵母菌容易死亡。因此，选定红心火龙果柚子汁酒精发酵的最佳温度为26 ℃。

2.1.2 酵母菌接种量对酒精度的影响

由图2可知，当酵母菌接种量低于0.4 g/L时，随着酵母菌接种量升高，酒精度升高；当酵母菌接种量高于0.4 g/L时，随着酵母菌接种量升高，酒精度降低；当酵母菌接种量为0.4 g/L时，酒精度最高，为4.2%。这可能是由于发酵液的营养成分影响了酵母菌的活性，酵母菌接种量较低时，营养成分过剩，酵母菌不能产生更多酒精；酵母菌接种量较高时，营养成分有限，反而抑制了酵母菌产生酒精。因此，选定红心火龙果柚子汁酒精发酵的最佳酵母菌接种量为0.4 g/L。

图2 酵母菌接种量对酒精度的影响Fig.2 The effect of inoculation amount of yeast on alcohol degree

2.1.3 红心火龙果汁柚子汁混合比例对酒精度的影响

图3 红心火龙果汁和柚子汁混合比例对酒精度的影响Fig.3 The effect of the proportion of red pitaya juice and pomelo juice on alcohol degree

由图3可知，当2种水果果汁比例低于1∶4时，随着柚子汁比例升高，酒精度升高；当果汁比例高于1∶4时，随着柚子汁比例升高，酒精度降低；当果汁比例为1∶4时，酒精度最高，为4.2%。这可能是由于发酵液的糖含量影响了酵母菌的活性，红心火龙果的甜度要高于柚子，如果红心火龙果汁比例过高，糖含量较高时，过高的糖含量反而抑制了酵母菌产生酒精；糖含量较低时，也不利于酵母菌发酵，不能产生更多酒精；因此根据酒精度，选定红心火龙果汁和柚子汁的最佳体积比例为1∶4。

2.1.4 红心火龙果柚子复合醋酒精发酵正交试验

表1 红心火龙果柚子复合醋酒精发酵正交试验设计Table 1 The design of orthogonal experiment for alcoholic fermentation of red pitaya and pomelo compound vinegar

表2 红心火龙果柚子复合醋酒精发酵正交试验结果Table 2 Orthogonal experimental results of alcoholic fermentation of red pitaya and pomelo compound vinegar

表3 红心火龙果柚子复合醋酒精发酵 正交试验结果方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal experimental results of alcoholic fermentation of red pitaya and pomelo compound vinegar

由表2可知RC>RA>RB，即红心火龙果汁与柚子汁的混合比例对红心火龙果柚子复合醋的酒精度影响最大，其次是温度，酵母菌接种量的影响最小，最优组合是A2B2C1，即温度为26 ℃，酵母菌接种量为0.4 g/L，红心火龙果汁与柚子汁的混合比例为3∶7。由表3可知，各因素的F比都小于F临界值，各因素的影响均不显著。

2.2 醋酸发酵单因素和响应面试验

2.2.1 发酵温度对醋酸含量的影响

由图4可知，在初始酒精度为8%、果醋菌接种量为500 mg/L、摇床培养1周后，当发酵温度在34 ℃以下时，醋酸含量随着发酵温度的升高而逐渐上升，从32 ℃开始，上升幅度明显增大。发酵温度为34 ℃时醋酸含量达到最高，为0.278 mol/L，温度超过34 ℃以后，醋酸含量随发酵温度的升高不断降低。温度对醋酸菌的生长影响较大，温度过低，醋酸菌生长缓慢，发酵周期延长，所以较低温度范围内，醋酸生成较为缓慢。但温度过高反而会抑制微生物细胞内某些酶的作用甚至使其丧失活性，加快了菌体老化，使发酵产酸降低。因此，选取34 ℃为红心火龙果柚子复合醋发酵的最佳温度。

图4 发酵温度对醋酸含量的影响Fig.4 The effect of fermentation temperature on acetic acid content

2.2.2 果醋菌接种量对醋酸含量的影响

图5 果醋菌接种量对醋酸含量的影响Fig.5 The effect of inoculation amount of acetic acid bacteria on acetic acid content

由图5可知，在发酵温度为34 ℃、初始酒精度为8%、摇床培养1周后，醋酸含量随果醋菌接种量的增加而增加，在果醋菌接种量为600 mg/L时达到最高，为0.341 mol/L，之后则随着接种量的增加而下降。接种量在一定范围内，较高的接种量有利于提高醋酸的产量，但如果接种量过大，由于醋酸菌的生长本身也会消耗掉发酵液中大量的营养物质，造成营养物质缺乏，醋酸形成不足。因此，选取600 mg/L为果醋菌的最佳接种量。

2.2.3 初始酒精度对醋酸含量的影响

由图6可知，在发酵温度为34 ℃、醋酸菌接种量为600 mg/L、摇床培养1周后，初始酒精度在10%以下时，醋酸含量随着初始酒精度的升高不断上升，初始酒精度为10%时达到最高，为0.146 mol/L。当初始酒精度大于10%之后，醋酸含量开始下降。酒精是醋酸菌进行繁殖代谢的主要营养物质，在醋酸发酵过程中，醋酸菌利用乙醇将其氧化成为醋酸和水。在一定范围内，提高发酵液中的初始酒精度，可以提高醋酸发酵过程的产酸量，但是过高的酒精浓度也会对醋酸菌的生长和代谢产生抑制作用。因此，选取初始酒精度10%为红心火龙果柚子复合果醋发酵的最佳条件。

图6 初始酒精度对醋酸含量的影响Fig.6 The effect of initial alcohol degree on acetic acid content

2.2.4 红心火龙果柚子复合醋醋酸发酵响应面试验

根据单因素试验结果，进行三因素三水平的响应面试验设计，结果见表4和表5。

表4 响应面分析因素及水平Table 4 The factors and levels of RSA

表5 响应面试验方案及试验结果Table 5 The scheme and results of RSA

表6 回归分析结果Table 6 The results of regression analysis

续 表

注：“*”表示差异显著(P<0.05)；“**”表示差异极显著(P<0.01)。

由表6可知，模型的P<0.0001<0.01，表明模型方程极显著，说明试验方法可行可靠；失拟项P=0.1745>0.05，失拟项不显著，说明回归方程的拟合度较好，能很好地反映工艺中各种因素和酸度(Y)之间的准确关系，能够利用回归方程式得出最优的工艺条件；模型的回归决定系数R2=0.9751，表明有97.51%的响应值变化是因为所选择的因素。X2对Y有显著影响，是正效应且极显著；交互项X1X2、X2X3对Y有显著影响，都为负效应，X1X2影响极显著；二次项X12、X22、X32也对Y有显著影响，都为负效应且影响极显著，其余的变量影响都不显著(P>0.05)。

经回归拟合后，得到回归方程：

Y=1.2-0.049X1+0.2X2-0.039X3-0.19X1X2-0.043X1X3-0.09X2X3-0.26X12-0.32X22-0.17X32。

对X1、X2、X3做如下变化：X1=(A-10)/2；X2=(B-34)/2；X3=(C-600)/100。

对回归方程的各个因素求二阶方程并计算，结果如下：X1=-1.38；X2=0.74；X3=-0.136。

把X1、X2、X3带入到变换的式子中，得到A，B，C分别等于7.24、35.48、586.4。即红心火龙果柚子复合果醋发酵工艺的最适初始酒精度、发酵温度、果醋菌接种量分别为7.24%、35.48 ℃、586.4 mg/L。响应值Y(酸度)为0.94 mol/L。

2.2.5 红心火龙果柚子复合果醋的工艺条件优化响应面图及等高线图

响应面分析及等高线图见图7～图9(图7～图9中的A，B，C分别代表X1、X2、X3)。

图7 Y=f(X1，X2)的响应面及等高线图Fig.7 Response surface and contour of Y=f(X1,X2)

注：Y表示响应值酸度(mol/L)，X1表示初始酒精度(%)，X2表示发酵温度(℃)。

图8 Y=f(X1，X3)的响应面及等高线图Fig.8 Response surface and contour of Y=f(X1,X3)

注：Y表示响应值酸度(mol/L)，X1表示初始酒精度(%)，X3表示果醋菌接种量(mg/L)。

图9 Y=f(X2，X3)的响应面及等高线图Fig.9 Response surface and contour of Y=f(X2,X3)

注：Y表示响应值酸度(mol/L)，X2表示发酵温度(℃)，X3表示果醋菌接种量(mg/L)。

图7显示响应面的坡度较陡，酸度受发酵温度和初始酒精度的影响较大；酸度随着发酵温度和初始酒精度的增加，呈现先增加后减小的趋势。从等高线密度来看，发酵温度轴向等高线密度相对较大，表明发酵温度对醋酸含量的影响比初始酒精度大。此外，等高线图中的椭圆度较大，表明发酵温度和初始酒精度两因素的交互作用较强，对酸度的影响显著。图8显示响应面的坡度较陡，表明酸度受接种量和初始酒精度的影响较大；酸度随着接种量和初始酒精度的增加，呈现先增加后减小的趋势。等高线图表明两因素轴向等高线密度相差不大，即初始酒精度和接种量对酸度的影响大致相同。图9显示响应面的坡度较陡，酸度受接种量和发酵温度的影响较大；酸度随接种量和发酵温度的增加，呈先增加后减小的趋势。从等高线密度可以看出，发酵温度轴向等高线密度相对较大，表明发酵温度对酸度的影响比接种量的影响大，发酵温度和接种量两因素的交互作用较强，对酸度的影响显著。

2.2.6 验证试验

为验证响应面法所得结果的正确性，根据实际情况对通过响应面试验获得的最佳发酵工艺条件进行修正，修正为初始酒精度7%、发酵温度35 ℃、果醋菌接种量586 mg/L，在此发酵工艺条件下重复红心火龙果柚子复合果醋发酵3次，测得平均酸度为0.98 mol/L，与预测值0.94 mol/L相对误差只有0.04%，可见模型能很好地预测红心火龙果柚子复合果醋发酵的实际情况，即基于响应面法优化的红心火龙果柚子复合果醋的发酵参数是比较可靠的。

3 结论

利用单因素试验和响应面法获得红心火龙果柚子复合果醋的最佳工艺条件为初始酒精度7.24%、发酵温度35.48 ℃、果醋菌接种量572.4 mg/L，由回归方程可得出在此条件下红心火龙果柚子复合果醋发酵的酸度理论值为0.94 mol/L。根据实际情况修正各因素值得到最优的因素条件为初始酒精度7%、发酵温度35 ℃、醋酸菌接种量586 mg/L，通过验证试验，发酵后复合果醋平均酸度为0.98 mol/L。红心火龙果柚子复合果醋呈暗红色、澄清透明、无杂质、无沉淀，具有火龙果和柚子的果香，酸甜适口，稍带柚子的涩味，风味协调。近年来，我国红心火龙果和柚子的种植高速发展，鲜果市场逐渐趋于饱和或过饱和状态。随着近年来人们生活水平不断提高，对食品的要求也越来越高，追求健康性和养生性。通过复合果醋的研制，为红心火龙果、柚子资源的开发和市场深加工，以及新型富营养果醋品种的开发提供了理论依据。