慢病毒介导的USP 9 X基因RNA干扰对人胰腺癌细胞株裸鼠移植瘤生长的影响

周晓华，刘志毅，张蓬波，张秀忠，任泽强#，孙文白，徐盼，吴耐，钱旭

1南京市高淳人民医院普通外科，南京 211300

2徐州医科大学研究生学院，江苏徐州221004

3徐州医科大学普通外科实验室，江苏 徐州 221000

4徐州医科大学附属医院胰腺外科，江苏 徐州 221000

胰腺癌是一种进展迅速、恶性程度极高、预后极差的消化系统恶性肿瘤。随着临床多模式综合治疗水平的逐渐提高，胰腺癌的治疗已经取得了一定进步，但由于胰腺位置较深、包膜不完整、血管及淋巴管丰富，胰腺癌极易出现局部侵袭及远处转移，此外，胰腺癌发病比较隐匿、早期诊断十分困难，患者就诊时往往已失去最佳的手术时机，导致胰腺癌患者的5年生存率＜5%[1]。近年来，随着对肿瘤分子生物学机制的深入研究，以某些肿瘤基因作为靶点的基因治疗可能为胰腺癌的治疗提供新的有效方法。

泛素-蛋白酶体途径是一个调节蛋白降解和功能的重要系统[2]，细胞内80%～90%的蛋白是通过泛素-蛋白酶体途径进行降解。随着对泛素-蛋白酶体途径的深入研究，发现蛋白的泛素化调节是一个可逆过程，细胞内同时还存在一些特异性的去泛素化酶（deubiquitinating enzyme，DUB）对其进行负反馈调节[3]。连锁的泛素特异肽酶9（ubiquitin specific peptidase 9 X-linked，USP9X）是泛素特异性蛋白酶亚家族的成员之一[4-5]，与肿瘤发生发展密切相关。目前，非小细胞肺癌[6]、食管癌[7]、前列腺癌[8]、宫颈癌[9]、结直肠癌[10]和肝癌[11]等恶性肿瘤中均发现存在USP9X的异常表达，且USP9X与上述恶性肿瘤的不良预后密切相关，但目前国内关于USP9X与胰腺癌关系的研究报道较少。

本研究小组前期的研究已经证实，胰腺癌组织中USP9X的表达明显上调，且与患者肿瘤分化程度、淋巴结转移情况和TNM分期密切相关；且对人胰腺癌细胞质粒的USP9X瞬时干扰后，肿瘤细胞增殖率明显降低，凋亡率明显升高[12]。本研究采用RNA干扰技术构建靶向USP9X基因的慢病毒感染载体，转染人胰腺癌SW1990细胞，通过裸鼠体内成瘤实验进一步验证USP9X与胰腺癌之间的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/C裸鼠18只，雄性，5周龄，体质量18～20 g，购自徐州医科大学实验动物中心。分笼饲养于屏障系统的洁净层笼架内（SPF级），室温控制为（25±1）℃，相对湿度为40%～60%。

1.2 细胞、载体和主要试剂

人胰腺癌细胞系SW1990由徐州医科大学肿瘤生物研究所提供。靶向USP9X基因的干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）序列设计及带有绿色荧光蛋白的慢病毒（LV-siRNA-USP9）、阴性对照慢病毒（LV-siRNA-NC）均购自苏州吉玛基因股份有限公司。DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Hyclone公司，Matorigel基质胶购自美国BD公司，青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶消化液均购自碧云天生物技术公司，兔抗人USP9X单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，兔抗人survivin单克隆抗体、TUNEL试剂盒购自瑞士Roche公司。

1.3 实验方法

1.3.1 胰腺癌细胞SW1990培养及慢病毒感染人胰腺癌细胞系SW1990常规复苏，采用含10%胎牛血清、青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基，在37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。当细胞生长至对数期时，按4×105/孔的浓度将SW1990细胞接种于6孔板中，24 h后按照1∶1比例更换含有慢病毒的不完全培养基。分别将LV-siRNA-USP9X和LV-siRNA-NC转染至人胰腺癌细胞系SW1990细胞中，分别作为siUSP9X组和siNC组，未转染细胞作为对照组，每组设置3个复孔，每孔均加入聚凝胺增强病毒的感染力，转染24 h后重新更换为完全培养基后继续培养。每隔24 h在荧光倒置显微镜下观察荧光阳性表达率，转染48 h后各孔加入含有2 μg/ml嘌呤霉素的培养液，筛选稳定转染的细胞，转染96 h后换液弃掉无嘌呤霉素抗性的细胞（非稳定转染细胞）。

1.3.2 蛋白质印迹（Western blot）法检测USP 9 X蛋白的相对表达量取3组对数生长期的SW1990细胞，采用放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度。常规制胶、上样，采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）进行电泳，转移至膜，5%脱脂牛奶封闭后加入兔抗人USP9X（1∶1000）和鼠抗人β-actin单克隆抗体（1∶6000）4℃孵育过夜。TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的兔抗人和鼠抗人二抗（1∶4000），室温下孵育1 h。电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显色液进行曝光处理，对蛋白质条带进行分析。干扰率（%）=（对照组相对表达量-siUSP9X相对表达量）/对照组相对表达量×100%。

1.3.3 胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立取对数生长期的3组细胞，胰蛋白酶消化，1000 r/min离心3 min后用含基质胶的DMEM培养基重悬细胞，制成约5×107/ml的细胞悬液（1∶1）。将制备好的细胞悬液接种于裸鼠右侧腋窝皮下（每只200 μl），根据皮下注射的细胞悬液的不同将18只裸鼠随机分为siUSP9X组（接种稳定转染的LV-siRNA-USP9X的SW1990细胞）、siNC组（接种稳定转染LV-siRNA-NC的SW1990细胞）和对照组（接种正常的SW1990细胞），每组6只。接种完毕后，将裸鼠均置于SPF级动物房中饲养，每5天观察成瘤情况并用游标卡尺测量瘤体长、短径，计算肿瘤体积，肿瘤体积（mm3）=（长径×短径2）×0.5，绘制肿瘤生长曲线。3组裸鼠生长30天后，以颈椎脱臼法处死，剥离并取出移植瘤组织，在电子天平上称重各组裸鼠肿瘤组织的重量，计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（对照组瘤重-siUSP9X瘤重）/对照组瘤重×100%。将一半瘤体组织置于液氮中，用于后续Western blot实验，另一半瘤体组织置于4%甲醛中固定用于后续免疫组织化学及TUNEL凋亡试验。

1.3.4 3组裸鼠皮下移植瘤木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色情况肿瘤组织4%甲醛固定后常规石蜡包埋，将蜡块进行4 μm切片，二甲苯、乙醇脱水，然后采用HE进行染色，用中性树胶封固后显微镜下观察染色结果。

1.3.5 Western blot法检测survivin蛋白的相对表达量提取3组裸鼠肿瘤组织中的总蛋白，BCA法检测survivin蛋白的相对表达量，检测方法同1.3.2。

1.3.6 免疫组织化学检测survivin蛋白的阳性表达情况采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法检测survivin蛋白的阳性表达情况，具体步骤按照说明书，survivin抗体工作浓度为1∶400。判定标准：survivin蛋白细胞质和（或）细胞膜，呈淡黄至棕黄色染色，不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分；阳性细胞数＜10%为0分，10%～45%为1分，46%～65%为2分，＞65%为3分。将免疫组织化学染色的深度和阳性细胞数评分相乘，0分判定为survivin蛋白表达阴性（-），1～6分判定为survivin蛋白表达阳性（+）[13]。

1.3.7 TUNEL法检测细胞凋亡率按照TUNEL试剂盒操作说明，滴加50 μl反应液于每张切片，37℃孵育1 h，再滴加50 μl HRP，室温晾干后二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，显微镜下观察SW1990细胞核呈棕色染色，判定为阳性，计算细胞的凋亡指数（apoptosis index，AI），AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒感染效率

LV-siRNA-USP9X和LV-siRNA-NC转染SW1990细胞后，siNC组和siUSP9X组细胞均有绿色荧光蛋白的表达，且转染96 h后荧光最强，慢病毒转染效率超过95%。（图l）

图1 siNC组和siUSP 9 X组SW1990细胞绿色荧光图（×100）

2.2 USP9X蛋白相对表达量的比较

Western blot法检测3组细胞USP9X的相对表达量，结果显示，siUSP9X组USP9X蛋白的相对表达量（0.11±0.03），均明显低于 siNC组的（0.95±0.18）和对照组的（0.98±0.21），差异均有统计学意义（t=3.67、3.71，P＜0.01），干扰效率约为90%。（图2）

图2 Western blot法检测USP9X蛋白的相对表达量

2.3 胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长情况

通过测量肿瘤长、短径计算肿瘤体积，并绘制出3组裸鼠皮下肿瘤的生长曲线，结果显示，siUSP9X组裸鼠的肿瘤体积明显小于siNC组和对照组裸鼠，且随着接种时间的延长，差异越来越明显（图3）。在接种第30天时，siUSP9X组裸鼠瘤体重量（0.79±0.13）g，小于siNC组裸鼠的（1.57±0.32）g和对照组裸鼠的（1.63±0.41）g，差异均有统计学意义（t=2.87、2.98，P＜0.05），抑瘤率为52%。

图3 siUSP9X组、siNC组和对照组裸鼠的肿瘤体积生长曲线

2.4 胰腺癌裸鼠皮下移植瘤HE染色情况

3组裸鼠皮下移植瘤中，肿瘤细胞核大深染，易见核分裂象，细胞质比例高，局部可见坏死。对照组组和siNC组肿瘤细胞呈弥散片状分布，低分化；而siUSP9X组肿瘤细胞部分出现“围管”现象（箭头所指）。（图4）

图5 3组裸鼠皮下移植瘤病理图（HE染色，×200）

2.5 Western blot法检测survivin蛋白的相对表达量

siUSP9X组裸鼠survivin蛋白的相对表达量（0.31±0.08），低于siNC组的（0.88±0.17）和对照组的（0.96±0.23），差异均有统计学意义（t=3.16、3.24，P＜0.05），而对照组和siNC组裸鼠survivin蛋白的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（图5）

图5 Western blot法检测 3组裸鼠皮下移植瘤组织中survivin蛋白的相对表达量

2.6 免疫组织化学染色检测surivin蛋白的阳性表达情况

免疫组织化学染色结果显示，survivin蛋白表达于细胞质和（或）细胞膜，呈现棕黄色或棕褐色染色（图6）。siUSP9X组survivin蛋白的阳性表达率为17%（1/6），低于siNC组的83%（5/6）和对照组的 100%（6/6），差异均有统计学意义（χ2=16.78、14.44，P＜0.05）。

图6 免疫组织化学染色检测 3组裸鼠移植瘤组织中survivin蛋白的阳性表达情况（×200）

2.7 TUNEL法检测细胞凋亡情况

siUSP9X 组细胞的 AI（32.36±1.94）%，高于siNC组细胞的（18.29±1.14）%和对照组细胞的（15.42±1.15）%，差异均有统计学意义（t=3.01、3.05，P＜0.05），而siNC组和对照组细胞的AI比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

USP9X位于人类基因组X染色体p11.4位点，全长150 945 bp，由2554个氨基酸残基组成，是DUB家族中泛素特异性蛋白酶亚家族的成员之一[13-14]。USP9X通过其去泛素化作用进行细胞蛋白质的修饰来调控蛋白质的功能[15]，参与蛋白酶体活性、器官生成、诱导肿瘤及转录调节等关键的生物学进程，且通过影响泛素化过程，参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和黏附等生物学过程[16]。目前USP9X在肿瘤中发挥的生物学效应及作用机制逐渐引起了人们的关注。

众所周知，胰腺癌是一种进展十分迅速、恶性程度极高的消化系肿瘤，因其早期诊断困难且预后差，已成为威胁人类健康的重要疾病之一[17]。目前国内关于USP9X在胰腺癌发生发展关系的研究甚少，2012年，Pérez-Mancera等[18]研究发现，胰腺癌组织中USP9X表达量明显低于正常胰腺组织，体内实验发现，下调USP9X的表达可明显促进肿瘤生长，表明USP9X抑制胰腺导管腺癌。2014年，COX等[19]研究结果显示，采用RNA干扰USP9X的表达后，5种胰腺癌细胞的生长明显受到抑制，且迁移、侵犯能力下降，与本研究小组前期的研究结果一致，表明USP9X属于胰腺癌的原癌基因。

为进一步采用体内实验验证USP9X与胰腺癌之间的关系，本研究采用慢病毒感染人胰腺癌SW1990细胞，建立了稳转细胞株，注入裸鼠皮下建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，模拟胰腺癌细胞在人体内的生物学行为。本研究选取雄性BALB/C裸鼠建立胰腺癌皮下移植瘤模型，因为裸鼠是免疫缺陷型小鼠，排斥性小，易于成瘤，且裸鼠已广泛用于建立人移植瘤肿瘤模型，人胰腺癌细胞系SW1990成瘤率高，成瘤周期短。本研究采用靶向USP9X基因的慢病毒（LV-siRNA-USP9X）感染人胰腺癌SW1990细胞，干扰USP9X的表达，并设空载慢病毒（LV-siRNA-NC）感染肿瘤细胞为阴性对照，筛选稳定细胞株，将LV-siRNA-USP9X、LV-siRNA-NC和空白对照对数生长期的细胞分别接种于裸鼠皮下，接种1周后18只裸鼠右侧腋窝皮下均可见成瘤，成瘤率100%，从肿瘤的生长曲线可以看出siUSP9X组裸鼠的肿瘤体积明显小于siNC组和对照组裸鼠，且随着接种时间的延长，差异越来越明显；且siUSP9X组裸鼠的瘤体重量明显减轻，表明体内慢病毒载体干扰USP9X表达能够稳定且持续的抑制裸鼠移植瘤的生长，这说明无论是在体外还是体内，RNA干扰USP9X后均可抑制胰腺癌肿瘤细胞的增殖能力，提示USP9X在胰腺癌中扮演原癌基因的角色。但Pérez-Mancera等[18]的研究结果与本研究的结果不同，COX风险比例模型等分析其原因可能包括以下两方面原因：①可能是因为USP9X在胰腺癌不同阶段发挥的作用不一样，USP9X在肿瘤早期发挥转化生长因子（transforming growth factor，TGF）类似的抑癌作用，而在进展期胰腺癌中，USP9X则作为一种原癌基因促进肿瘤细胞的增长和转移。②可能是因为USP9X作用的底物不同导致其发挥的作用也不一样，作为原癌基因，USP9X可稳定髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）的表达，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤生长，而Pérez-Mancera等[18]设计的动物模型主要是由Kirsten鼠肉瘤病毒原癌基因同源体（Kristen rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）基因突变引起的胰腺癌，干扰USP9X表达可激活原癌基因KRAS从而促进肿瘤生长。但Pérez-Mancera等[18]的研究中人体胰腺癌组织中USP9X表达明显下调的原因尚需进一步研究，USP9X与患者不良预后的关系也尚需进一步研究。

细胞增殖和凋亡的平衡对维持多细胞生物体的稳态至关重要。平衡破坏可导致存在基因缺陷的细胞得以存活，导致基因突变和细胞的恶性转化，最终导致肿瘤的发生和发展[20]。研究发现，survivin是目前发现的最强也是最小的凋亡抑制因子，是在胰腺癌的发生、发展中发挥重要作用的癌基因，能直接抑制凋亡途径中终末效应因子caspase-3、caspase-7的活性，阻断细胞的凋亡过程[21-22]。与其他蛋白一样，survivin蛋白也通过泛素-蛋白酶体途径降解，理论上USP9X应该会抑制survivin蛋白降解。本研究在裸鼠接种的第30天，以颈椎脱臼法处死各组裸鼠，剥离并取出皮下移植瘤组织，采用TUNEL法检测皮下移植瘤裸鼠细胞的AI，结果显示，siUSP9X组裸鼠的AI明显高于siNC组及对照组裸鼠；同时，采用免疫组织化学染色检测survivin蛋白表达情况，发现siUSP9X组裸鼠survivin蛋白的阳性表达率低于siNC组和对照组裸鼠。

综上所述，慢病毒介导的USP9X基因沉默可明显抑制人胰腺癌细胞系裸鼠皮下移植瘤的生长，该现象可能与其下调survivin蛋白的表达并促进细胞凋亡有关，USP9X有可能成为胰腺癌基因治疗的一个新靶点。