趋化因子受体 3对乳腺癌调控机制的探究及其临床意义△

陈超英，陈苗苗，刘灵芝，伍仙，朱一喜，何树光#

1湖南中医药高等专科学校附属第一医院（株洲市中医院）检验科，湖南 株洲 412000

2中南大学湘雅医学院附属株洲医院/株洲市中心医院放射影像科，湖南 株洲 412000

乳腺癌是发生于乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。近年来，乳腺癌在全球范围内的发病率呈逐渐上升趋势，严重威胁着女性的身心健康，是当前社会的重大公共卫生问题，目前，其具体的发病机制尚不十分明确[1-2]。趋化因子及其与受体的结合均对肿瘤的发生、发展发挥着重要的调控作用，而趋化因子受体 3（chemokine receptor 3，CCR3）是CCR家族中的重要成员。据报道，CCR3在细胞的增殖与状态转变中发挥着重要的作用[3-5]，且在嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）中呈高表达，可促进EOS的分化成熟[6-7]。EOS可作为延长乳腺癌患者生存期的重要指标[8]。目前，CCR3对乳腺癌的调控机制尚不十分明确，本研究通过分析61例乳腺癌患者的乳腺癌组织及其癌旁组织中CCR3的表达情况，观察50例乳腺癌患者及50例正常受试者外周血中EOS的计数及所占白细胞比例，探究CCR3对乳腺癌细胞增殖和转移的调控机制，旨在为从趋化因子层面发现治疗乳腺癌的新思路和发掘治疗乳腺癌的新靶点提供理论基础。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取湖南中医药高等专科学校附属第一医院收治的50例乳腺癌患者作为乳腺癌组。纳入标准：经组织病理学检查确诊为乳腺癌；均为女性。排除标准：合并其他血液系统疾病，如粒细胞白血病等；合并严重的感染性疾病；检测前一个星期内行化疗。乳腺癌组患者的年龄为32～76岁，中位年龄为46岁；发生淋巴结转移28例，未发生淋巴结转移22例；病理类型：激素受体（hormone receptor，HR）阳性乳腺癌36例，HER2阳性乳腺癌12例，三阴乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）2例。选取同期50例健康体检者作为对照组，纳入标准：均为女性；体检指标正常；血常规正常。排除标准：患有血液系统疾病；感染性指标如白细胞、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）升高；患有其他影响研究的相关疾病，如肿瘤、传染性疾病、寄生虫过敏等。50例对照组受试者的年龄为30～70岁，中位年龄为43岁。本研究通过湖南中医药高等专科学校附属第一医院医学伦理委员会的审核批准，患者及家属均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 标本采集及检测方法

采集乳腺癌组患者和对照组受试者的清晨空腹静脉血2～3 ml，注入乙二胺四乙酸二钾（ethylenediaminetetraacetic acid-K2，EDTA-K2）抗凝管中，轻轻颠倒混匀数次，备注相关信息，待测。运用希森美康血细胞计数仪上机检测，同时进行血涂片观察，测量EOS数目及比例3次，记录平均值。上述过程每2周重复进行1次，至少进行3次，获取数据待分析。

1.3 其他数据获取及分析

从癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）（https://cancergenome.nih.gov）数据库中获取乳腺癌基因表达数据集。该数据集共包含532例乳腺癌患者的样本数据，其中，61例浸润性乳腺癌患者的乳腺癌组织具有配对的癌旁组织样本数据，因此，本研究选取此61例配对样本分析CCR3在乳腺癌组织及其癌旁组织中的表达情况。从美国国立生物技术信息中心的高通量“基因表达大棚车（gene expression omnibus，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）”基因芯片数据库中下载登录号为GSE3494的基因芯片数据集，共包含251例乳腺癌患者的乳腺癌基因表达数据。同时，通过GEO数据库获取登录号分别为GSE1456、GSE6532、GSE7390的基因芯片数据集，共包含914例乳腺癌患者的临床资料及乳腺癌基因表达数据。根据CCR3的表达值将914例乳腺癌患者分为3组：-4.994～-0.625为低表达组，-0.626～0.776为中等表达组，0.777～4.164为高表达组；分析CCR3表达与乳腺癌患者无复发生存（relapse free survive，RFS）之间的关系。

1.4 生物信息学分析

在编号为GSE3494的基因芯片数据集中，以探针208304_at提取CCR3在251例乳腺癌中的表达值，根据中位数，将乳腺癌患者的乳腺癌组织标本分为高低两组，同时通过基因集合富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）网站（http://software.broadinstitute.org）下载与乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移相关的基因子集。采用GSEA3.0软件对乳腺癌组织中CCR3的表达与乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移相关基因的关系进行基因富集分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，应用GraphPad Prism 7.0软件绘图；计量资料以均数±标准差（±s）表示，配对设计样本采用配对t检验；生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，生存情况的比较采用Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 61例乳腺癌及其癌旁组织中CCR 3 mRNA的表达情况

分析TCGA数据库中61例浸润性乳腺癌及其癌旁组织中CCR3mRNA的表达水平，结果显示，乳腺癌组织中CCR3的中位表达水平为0.865，明显高于癌旁组织的0.661，差异有统计学意义（t=13.530，P＜0.01）。

2.2 CCR 3与251例乳腺癌患者乳腺癌细胞增殖、转移的关系

通过对251例乳腺癌患者的乳腺癌基因芯片数据进行基因富集分析发现，CCR3的表达与乳腺癌细胞的增殖、转移呈正相关。与乳腺癌细胞增殖相关的基因子集多数富集在CCR3高表达区的红色区域，且与富集在CCR3低表达蓝色区域相比，差异有统计学意义（P=0.015）（图1A）。CCR3富集在CCR3高表达区域，与在转移的乳腺癌细胞中上调的相关基因子集呈明显正相关（P＜0.01）（图1B）；CCR3富集在CCR3低表达区域，与在浸润性乳腺癌细胞中下调的相关基因子集呈明显负相关（P＜0.01）（图1C）。

图1 CCR 3表达与251例乳腺癌患者乳腺癌细胞增殖和转移关系的GSEA分析

2.3 CCR 3与914例乳腺癌患者RFS率的关系

根据CCR3的表达值分为CCR3低表达组（n=315）、CCR3中表达组（n=298）、CCR3高表达组（n=301）。Log-rank检验结果显示，三组乳腺癌患者的RFS情况比较，CCR3高表达组乳腺癌患者的RFS情况更优（P=0.008）。（图2）

图2914 例乳腺癌患者的无复发生存曲线

2.4 外周血中EOS数量的比较

通过对50例乳腺癌患者和对照组受试者外周血中的EOS进行检测发现，乳腺癌患者外周血中EOS的计数及其所占白细胞比例中位水平分别为（0.04×109）/L、0.6%，均明显低于对照组受试者的（0.15×109）/L、2.4%，差异均有统计学意义（t=3.539、4.983，P＜0.01）。

3 讨论

乳腺癌是危害女性身心健康的常见恶性肿瘤之一，在中国及全世界范围内，其发病率和病死率呈上升趋势，已成为亟待解决的重大公共卫生问题。目前，乳腺癌的发生、发展机制尚不十分清楚。乳腺癌为异质性肿瘤，临床上将乳腺癌分为3个亚型：HR阳性乳腺癌，此类乳腺癌包括雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性和（或）孕激素受体（progestin receptor，PR）阳性乳腺癌；人类表皮生长因子 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）过表达乳腺癌；TNBC——缺乏ER和PR表达，HER2表达水平正常或阴性表达[9]，分子标记不同，治疗方式、预后及对治疗的反应均不同[1]。而趋化因子及其受体在许多疾病尤其肿瘤中发挥着重要的作用，而其在乳腺癌中作用机制的研究尚处于起步阶段。

CCR3作为趋化因子家族中的重要成员之一，CCR3基因位于染色体3p21，具有5个外显子，编码373个氨基酸。起初被定义为EOS介导受体，也有报道称其为嗜碱性粒细胞激活的生物标志物[10-11]。相关研究发现，CCR3不但能够促进黑色素瘤发生淋巴结转移，而且能够促进内皮细胞的增殖，并转化细胞状态形成新的血管[3-5]。研究表明，免疫组织化学染色结果显示，CCR3在乳癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织（P＜0.01），但是CCR3蛋白的表达与乳腺癌患者的临床分期、淋巴结转移情况、病理分型等无关[12]。

本研究结果显示，61例浸润性乳腺癌组织中的CCR3处于高表达状态，且乳腺癌患者外周血中EOS的计数及其所占白细胞比例中位水平均明显低于对照组（P＜0.01），表明EOS参与对乳腺癌的调控。且有研究还发现，EOS对肿瘤细胞具有一定的抑制作用，而CCR3为EOS的介导受体，可募集EOS[13]，表明EOS可能参与CCR3对乳腺癌的调控过程。本研究通过对GEO数据库所获取的数据进行GSEA分析，结果显示，乳腺癌组织中CCR3的高表达与乳腺癌细胞的增殖及转移相关的基因通路子集呈正相关，表明CCR3可能通过EOS调控乳腺癌的增殖、转移，从而促进乳腺癌的发生、发展。本研究通过对251例乳腺癌患者的乳腺癌基因芯片数据进行基因富集分析发现，CCR3的表达与乳腺癌的增殖、转移呈正相关，表明CCR3可提高乳腺癌患者的无复发生存率。

CCR3需要与其配体结合方能发挥对肿瘤的调控作用；该过程是一个复杂的调控过程，而乳腺癌中CCR3与转移相关的基因子集呈正相关，而肿瘤细胞转移的发生同样是一个复杂的过程，影响肿瘤细胞转移的因素有很多，不一定局限于某种特定的肿瘤细胞转移方式，也可能与其他转移方式有关，如循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）的形成，同时CCR3可能通过调控机体的免疫系统影响肿瘤细胞的转移。同样，本研究探究了乳腺癌组织中CCR3的表达情况及其与患者RFS情况之间的关系，发现CCR3的表达可以提高乳腺癌患者的RFS率。

综上所述，CCR3可能通过EOS对乳腺癌细胞的增殖和转移进行调控，但CCR3是否可在乳腺癌中发挥促进乳腺癌细胞增殖和转移以及提高患者无复发生存率的双重作用，还有待进一步深入探究。