獐宝治疗胃癌前病变的机制研究△

王媛媛，郑亮，姜正艳

南京中医药大学第二附属医院（江苏省第二中医院）脾胃病科，南京 210017

胃癌是严重危害人们健康的疾病，起病隐匿，早期常因无明显症状而漏诊，易转移和复发，预后差。胃癌的发生很少直接从正常胃黏膜上皮产生，而是在癌变前经历相当长的演变过程。现今，国内外大多数学者认可的胃癌发病模式为：慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）→肠化生（intestinal metaplasia，IM）→异型增生[dysplasia，Dys；不典型增生，现归于上皮内瘤变（intraepithelial neoplasia，IN）]→胃癌。2000年WHO公布的新版消化系统肿瘤病理学和遗传学分类中[1]，将IN和肠化生视为胃癌的癌前病变（precancerous lesion of gastric cancer，PLGC）[2]。目前胃癌的治疗手段仍不能降低其高病死率，所以，PLGC的早诊断、早治疗，是提高胃癌患者生存率的唯一有效措施。现代医学对治疗CAG及PLGC尚无理想的疗法，而中医治疗具有一定优势。其讲究整体观念，重视辨证论治，药食兼顾，综合治疗，弥补西药治疗片面的不足，疗效肯定，不良反应小。獐宝是鹿科动物幼獐吮吸獐奶后在胃中凝结的奶块，属于名贵稀有药材，早在《本草纲目》中就有记载，主要用于小儿疳积、功能性消化不良等。江苏省第二中医院脾胃病科郑亮教授运用獐宝治疗慢性萎缩性胃炎PLGC临床取得满意疗效。基于临床研究前的动物实验研究发现，獐宝治疗大鼠CAG，逆转肠上皮化生、轻度-中度不典型增生有较好疗效[3]。本研究旨在进一步探讨獐宝治疗PLGC的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

14只清洁级Wistar雄性大鼠由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，体重为180～220 g，共分为4组，每组3只，剩余2只16周时取样观察造模情况。胃复春购自杭州于庆堂制药有限公司，獐宝购自南京万御宝生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组将12只雄性大鼠随机分为空白组、模型对照组、胃复春治疗组、獐宝治疗组，每组3只大鼠。

1.2.2 造模采用MNNG自由饮水法配合抑酸、饥饱失常及脱氧胆酸钠、乙醇灌胃法联合造模，空白组给予等量生理盐水灌胃。于造模16周末将待观察造模情况的2只大鼠，取胃窦及胃体组织各1块，采用常规苏木素-伊红（hematoxyli-eosin，HE）染色，用20%福尔马林固定后，光镜下观察胃黏膜均存在萎缩，且出现肠上皮化生和不典型增生，确认造模成功。

1.2.3 给药处理造模16周后，獐宝治疗组给予獐宝56 mg/kg灌胃，胃复春治疗组给予胃复春25.13 ml/kg灌胃，空白组、模型对照组给予生理盐水10 ml/kg灌胃，每日1次，每周6次，连续给药时间均为12周。

1.2.4 样本取材给药12周后处死大鼠，剖腹取胃，在胃大弯侧剖开全胃，取出0.2 cm×0.2 cm长条形胃组织，迅速放于4%甲醛溶液中固定，24 h后用石蜡包埋，进行HE染色及免疫组织化学染色，光镜下观察胃黏膜变化（胃组织实验前保存于4℃条件下）。

1.3 HE染色

HE染色后观察各组大鼠胃黏膜、血管生成、炎症细胞浸润情况。由专业病理人员在光学显微镜下阅片，根据病变轻重程度不同，依次标记为“-”“+”“++”“+++”，分别赋值为0、1、2、3分，其中“-”为无明显病理改变，“+++”为严重的病理改变。

1.4 免疫组织化学检测

应用免疫组织化学检测方法通过特异性抗体检测各组胃组织中热休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）、热休克蛋白 90（heat shock protein 90，HSP90）、B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 assaciated X protein，BAX）、存活蛋白（survivin）的表达。具体方法：首先白片37℃烤过夜，予梯度乙醇脱水，二甲苯1，2，3各10 min，100%、95%、90%、80%、70%、50%乙醇各2 min，蒸馏水1 min，Tris-HCl缓冲盐溶液（Tris-HCl buffered saline，TBS）洗3次，每次5 min，待抗原修复后自然冷却，TBS洗3次，每次5 min，将切片放入3%H2O2溶液，室温孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶，然后TBS洗3次，每次5 min，甩干后予5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭20 min，去除BSA液，每张切片加入50 μl稀释的一抗覆盖组织，4℃过夜，再TBS洗3次，每次5 min，去除磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），每张切片加入 50～100 μl相应的二抗，于4℃孵育50 min，TBS洗3次，每次5 min，去除TBS液，每张切片再加入50～100 μl新鲜配制的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，显微镜控制显色后，用蒸馏水冲洗，苏木素染色25 s，之后用自来水冲洗3～5 min返蓝，蒸馏水1 min，然后50%、70%、80%、90%、100%乙醇分别浸泡1 min，二甲苯1，2，3分别浸泡数分钟，晾干，滴加中性树胶，然后封片。

结果分析方法：采用图像分析系统对上述蛋白的表达进行定量分析，每张切片随机选取3个完整而不重叠的高倍视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度值作为表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

HE染色评分比较，模型对照组、獐宝治疗组、胃复春治疗组均高于空白组，獐宝治疗组与胃复春治疗组均低于模型对照组，胃复春治疗组高于獐宝治疗组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表1）。HE染色结果显示，空白组胃黏膜上皮完整，表面光滑，无糜烂，细胞形态均一，腺体排列整齐，散在少量淋巴细胞，固有层无炎症细胞浸润，黏膜下层无水肿。模型对照组胃黏膜部分腺体萎缩消失，黏膜肌层的平滑肌呈束状增生插入黏膜固有层，腺管腔变大，病变黏膜固有层可见慢性炎症细胞浸润，且浸润深达黏膜肌层，甚至有淋巴细胞聚集及淋巴滤泡形成，基底部腺体上皮增生，可见杯状细胞，核深染，有肠上皮化生及低级别IN。胃复春治疗组胃黏膜上皮较模型对照组完整，细胞形态比较均一，固有腺体排列齐密，散在少量淋巴细胞，腺上皮和腺管分界清楚，炎症细胞浸润主要局限于黏膜浅层。獐宝治疗组胃黏膜厚度适中，腺体排列较规则，部分黏膜固有层有少量淋巴细胞、浆细胞，偶见嗜酸性粒细胞浸润，黏膜上皮细胞及腺细胞形态无异型（图1）。

表1 各组HE染色评分的比较（±s）

表1 各组HE染色评分的比较（±s）

注：a与空白组比较，P＜0.05；b与模型对照组比较，P＜0.05；c与獐宝治疗组比较，P＜0.05

组别空白组模型对照组獐宝治疗组胃复春治疗组F值P值0±0 2.78±0.44a 1.22±0.44a b 1.88±0.35a b c 32.240 0.000 HE染色评分

图1 各组大鼠胃黏膜的病理结果（HE染色，×400）

2.2 免疫组织化学检测结果

模型对照组胃黏膜组织中HSP60、HSP90、Bcl-2、survivin蛋白表达量均低于空白组，BAX蛋白表达量高于空白组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；獐宝治疗组胃黏膜组织中HSP60、HSP90、Bcl-2、survivin蛋白表达量均高于模型对照组，BAX蛋白表达量低于模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2、表3）

表2 各组胃黏膜组织中HSP60、HSP90表达量的比较（±s）

表2 各组胃黏膜组织中HSP60、HSP90表达量的比较（±s）

注：a与空白组比较，P＜0.05；b与模型对照组比较，P＜0.05

组别空白组模型对照组獐宝治疗组胃复春治疗组F值P值63.42±9.19 24.99±3.33a 40.35±4.08a b 30.93±4.11a 26.52 0.000 66.03±5.75 18.66±4.14a 42.16±9.83a b 32.59±6.98a 24.39 0.000 HSP60 HSP90

表3 各组胃黏膜组织中Bcl- 2、BAX、survivin表达量的比较（±s）

表3 各组胃黏膜组织中Bcl- 2、BAX、survivin表达量的比较（±s）

注：a与空白组比较，P＜0.05；b与模型对照组比较，P＜0.05

组别空白组模型对照组獐宝治疗组胃复春治疗组F值P值57.82±6.37 27.03±6.56a 42.16±6.47b 34.91±5.90a 12.86 0.002 20.75±4.61 64.60±6.61a 34.63±6.69a b 42.45±5.75a b 28.27 0.000 59.50±7.46 24.95±5.68a 41.62±4.93a b 35.30±3.86a 19.85 0.001 Bcl-2 BAX survivin

3 讨论

近年来研究表明，细胞凋亡的异常是胃黏膜癌变的重要原因之一。胃黏膜癌变启动阶段可能存在着活跃的细胞增殖和大量细胞凋亡共存的现象[4]。Bcl-2在凋亡调控中起关键作用，是保护细胞免受凋亡的重要凋亡抑制基因[5]。BAX也是Bcl家族中的一员，具有抑制Bcl-2，促进凋亡的作用。抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白BAX的比例在维持体内平衡中起重要作用，Bcl-2蛋白表达占优势时可使细胞免遭凋亡；反之，BAX蛋白表达占优势时则促进细胞凋亡。survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，拥有最强的凋亡抑制作用[6]，具有抑制细胞凋亡，促进细胞转化等作用。本实验中，与空白组相比，模型对照组大鼠Bcl-2、survivin表达减少，BAX表达增加正印证了癌变初期存在细胞凋亡活跃现象。而獐宝治疗组可以增加Bcl-2、survivin表达，减少BAX表达，从而避免凋亡过度激活。HSP又称作应激蛋白（stress protein，SP）[7]。近年来研究发现，HSP与肿瘤的发生发展存在一定关系[8]。HSP60是原核细胞和真核细胞的分子伴侣，可能参与了肿瘤特殊信号的转导，在胃黏膜炎性反应、萎缩和癌变中的作用近年来也越来越受到重视。在胃黏膜萎缩初期，HSP60蛋白表达是增加的。随着萎缩程度的加重，表达反而下降，疾病进展过程中呈现出双向性。一般认为HSP60具有抗凋亡作用。HSP90不仅参与蛋白的运输、解聚以及保护细胞免受环境压力，同时还参与了抗感染、肿瘤免疫、自身免疫，可能对肿瘤细胞的增殖和存活起着重要的作用。本实验中，与空白组相比，模型对照组HSP60、HSP90蛋白表达减少（P＜0.05），与模型对照组相比，獐宝治疗组HSP60、HSP90蛋白表达增加（P＜0.05）；这一结果与部分文献报道不一致[9-10]，可能因为以上指标同时具有抗凋亡和促凋亡的作用，使之在恶性肿瘤的表达中呈现双向性，即促进凋亡或抑制凋亡。CAG向胃癌的发展是个多步骤缓慢的过程，是正常细胞增殖与凋亡平衡打破的过程，这一过程非常微妙，一些目前仍未知的凋亡通路中的蛋白表达决定了对凋亡的影响，本研究得出的结果是在不同个体的同一疾病状态下凋亡蛋白的表达，验证以上推论还需要监测同一个体在不同疾病状态下凋亡蛋白的表达。

综上所述，胃PLGC造模后，细胞凋亡处于活跃状态。而给予胃复春及獐宝治疗一定程度可减少凋亡的过度激活，且獐宝的治疗效果较为显著。