西瓜枯萎病病原菌分离纯化及生物防治

谷富强， 王袆玮， 高春情， 王雨停， 陈心怡， 刘京华

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

西瓜枯萎病又称死秧病或萎蔫病,在西瓜成长的各个时期均可发病。发病早期,病株茎蔓上的叶片由基部向两端逐渐枯萎,呈现缺水状,短时间内萎蔫尚可恢复。但是数日后,叶片干枯下垂而死亡[1-2]。病株韧皮部表皮纵裂,有胶质类首脓溢出,用根茎部维管束逐步变为褐色[3]。此病具有传染性还可以在植株间迅速传播,导致西瓜大面积减产。近年来,西瓜枯萎病的发病率呈逐年上升趋势,严重影响着农业经济的发展。因此,进行西瓜枯萎病的防治工作刻不容缓。

目前,国内外普遍采用嫁接法、化学法等手段防治西瓜枯萎病。嫁接法能够很好地增强西瓜对枯萎病的抵抗力和自身的产量,被认为是西瓜枯萎病防治的一个有效措施。但是嫁接法往往工作量巨大往往还会导致西瓜品质的降低[4-5]。化学防治法是采用喷洒农药的方式来防治西瓜枯萎病,但是长期施药会导致枯萎病菌的抗药性甚至还会带来环境污染,而且西瓜中的农药残留还会危害人体健康[6-8]。

研究表明某些植物的天然提取物具有很强的杀菌能力,可以有效防治一些菌类感染病[9]。苦瓜含有苦瓜苷、苦瓜素等多种营养成分,具有保健和降血糖的显著功效。进年来研究发现,苦瓜籽蛋白质组分复杂具有很好的抗病毒和抑制真菌生长的作用[10-11]。采用天然提取物的生物防治手段具有使用浓度低、防治效果好、易分解、对人畜危害小等独特优势。故本试验苦瓜为防治材料,提取苦瓜籽粗提液中的蛋白,研究其对西瓜枯萎病病原菌的抑制情况,力求为西瓜枯萎病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 西瓜幼苗(安徽科技学院种植园基地5号大棚中培育),苦瓜(菜市场购买)。

1.1.2 培养基 PDA培养基:马铃薯60.0 g,葡萄糖6.0 g,琼脂5.0 g,自来水300.0 mL,pH自然。马丁氏培养基:KH2PO40.5 g,MgSO4·H2O 0.25 g,蛋白胨2.5 g,葡萄糖5.0 g,琼脂8.5 g,自来水500 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 西瓜枯萎病病原菌的分离纯化 从安徽科技学院种植园基地地瓜田中获取典型西瓜枯萎病株,剪去不枯萎的茎蔓,将枯萎的茎蔓表皮除去获得维管束,分别置于PDA培养基上培养[12],马丁氏培养基分离纯化,纯化后前株保存备用。

1.2.2 病原菌转染试验 将在试管斜面中保藏的西瓜枯萎病病原菌中加入5 mL无菌水,用涂布棒刮下菌丝后经3层纱布过滤,加入无菌水中制成孢子悬液[13]。然后把种植的西瓜植株经轻微伤根处理后分别在在孢子悬液和无菌水中浸泡2 h后取出,将其放置在加无菌土的穴盘中培养,放置在同一环境中定期浇水处理并观察两种处理的植株生长的情况。

1.2.3 苦瓜蛋白粗提液的制备 把苦瓜籽从新鲜苦瓜中取出,去掉外面一层硬壳,将其剪碎并称重6 g,加入12 mL pH 7.4的磷酸缓冲液,低温冰浴研磨。研磨后经四层纱布过滤,将过滤后的苦瓜籽提取液加入灭菌的离心管中然后进行离心(10 000 r/min,4 ℃,15 min),离心后取上清液,获得苦瓜籽粗提液[14]。

1.2.4 PDA培养基中的抑菌试验 在超净工作台中向枯萎病病原菌的试管斜面中加入5 mL无菌水,用无菌的涂布棒刮下一部分菌落,待培养基冷却至55～60 ℃,用3层无菌纱布将试管斜面中的孢子液倒入PDA培养基中,混匀后迅速倒平板(混菌法)。待培养基凝固后,将灭菌的打孔滤纸片分别放入苦瓜籽蛋白粗提液原液和无菌水中浸泡3 min,然后用镊子夹取滤纸片放入培养基的4个地方并做上标记,放入28 ℃的培养箱中培养并观察[15]。

1.2.5 苦瓜籽蛋白含量的测定 蛋白质含量的测定选用蛋白质定量检测试剂盒(A045-3,南京建成生物工程研究所)。分别用0.281 5、0.140 8、0.037 5、0.018 8 g/L的蛋白质溶液绘制标准曲线。取5 mL的离心管,分别加入40 μL的双蒸水、标准蛋白稀释液和苦瓜籽蛋白粗提液。再向每个离心管中加入0.5 mL的工作液,混匀后放入37 ℃的培养箱中反应30 min。反应结束后向每个离心管中加入1.5 mL的终止液,混匀后静置5 min，然后用分光光度计在562 nm波长下测定吸收值。

2 结果与分析

2.1 西瓜枯萎病的分离和鉴定

由图1可知，从枯萎的西瓜幼苗分离得到的枯萎病病原菌的小分生孢子、大分生孢子以及病原菌菌落与布斯等人对尖孢镰刀菌菌落的颜色、小分生孢子和大分生孢子的形态描一致[16],鉴定离菌株是西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌。

图1 西瓜枯萎病病原菌分生孢子显微图(a和b)以及菌落图(c)

2.2 枯萎病病原菌的转染与纯化

图2a和b为利用分离得到的西瓜枯萎病病原菌孢子转染后的幼苗,可以看出转染后西瓜幼苗表现出叶片下垂、干枯等枯萎病的症状；c和d为利用无菌水处理的对照组,植株叶片长势良好没有感染病枯萎病病原菌。由此可以看出西瓜枯萎病病原菌对西瓜幼苗有很强的感染能力。

图2 西瓜枯萎病菌转染后的西瓜幼苗

图3为从再次感染枯萎病致病菌后的西瓜幼苗分离得到的病原菌的小分生孢子、大分生孢子。通过观察可以看出其显微结构和形态与第一次分离得到的分生孢子结果一致。

2.3 西瓜幼苗转染后枯萎病菌的鉴定

图3 西瓜枯萎病病原菌分生孢子显微图

2.4 苦瓜籽蛋白OD562标准曲线

图4 蛋白质标准曲线

由图4可得，试验得到蛋白质标准曲线:y=0.651 9x,R2=0.995 1。根据蛋白质标准曲线计算得到苦瓜籽粗体液中蛋白浓度为1.189 g/L。

2.5 抑菌圈

图5 苦瓜籽提取物的抑菌试验

利用苦瓜籽提取物处理的打孔滤纸与涂有枯萎病菌分生孢子液的固体平板培养3天后的试验结果(图5)。可以看出利用无菌水处理的a和b打孔滤纸周围没有出现抑菌圈,而利用枯萎病菌孢子悬液处理的c和d打孔滤纸周围有抑菌圈出现。因此,苦瓜籽蛋白粗提液对西瓜枯萎病病原菌有一定抑菌效应,可以开发和应用于西瓜枯萎病的防治。

3 结论与讨论

枯萎病是镰刀菌属真菌寄生导致的一种全球性的土传病害,尖孢镰刀菌为主要的病菌种类之一并且引起瓜类枯萎病的专化型一共有8个[17-18]。本试验对安徽科技学院种植园基地的西瓜枯萎病病原菌进行了分离纯化、孢子形态学以及致病性方面做了研究,鉴定结果表明该病原菌是镰刀菌属的西瓜专化型尖孢镰刀菌。进一步利用盆栽转染的方法对其侵染性进行了研究,试验结果表明经过伤根处理后的西瓜幼苗很容易被枯萎病病原菌孢子感染。最后研究发现苦瓜籽蛋白粗提液对西瓜枯萎病病原菌有一定的抑制作用,但是具体的抑制机制与机理还不清楚,有待进一步的深入研究。