不同碳氮源培养蛹虫草液体菌种及栽培试验

杨心如 刘瑞香，* 郭占斌 曹 莉

（1内蒙古农业大学草原与资源环境学院/草地资源教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特010011；2内蒙古农业大学沙漠治理学院，内蒙古呼和浩特010011；3内蒙古益稷生物科技有限公司，内蒙古呼和浩特010011）

蛹虫草（Cordyceps militaris）又名北冬虫夏草，武氏虫草、蛹草等。它寄生于夜蛾科昆虫蛹上，真菌分类学上与冬虫夏草相似，是一种药用兼食用真菌[1]。蛹虫草的有效成分及药理作用与冬虫夏草相似，甚至高于冬虫夏草，蛹虫草已被认为是理想冬虫夏草的替代品[2-4]。虫草多糖是虫草中含量最高活性物质，具有刺激机体产生抗体、增强免疫力以及抗肿瘤活性[5]，虫草多糖的含量与蛹虫草功效直接相关。

液体菌种在蛹虫草人工栽培中已经广泛应用[1-10]。液体培养基中碳氮源的种类、培养方法、培养条件都会影响蛹虫草液体培养菌丝的生长。目前对蛹虫草液体培养的研究主要集中在不同液体培养基配方对液体菌丝体生物量和菌丝体有效成分含量的影响，关于不同液体培养基培养的液体菌种对子实体生长及其活性成分含量影响的研究较少。菌丝生物量是衡量菌种质量的一个重要指标，子实体产量又是菌种质量的体现，虫草多糖含量决定了虫草质量。为此，笔者对培养蛹虫草液体培养基的碳、氮源进行单因素比较试验以及培养菌种栽培蛹虫草比较试验，通过测定蛹虫草液体培养菌丝生物量、子实体鲜重及虫草子实体多糖含量，分析不同碳氮源对液体菌种和蛹虫草子实体产量和质量的影响，找到最佳碳源、氮源及其适宜浓度，以达到提高蛹虫草质量和产量的目的。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及培养基

蛹虫草菌株04-18由内蒙古益稷生物科技有限公司提供。

液体培养基础培养基：马铃薯250 g（去皮煮汁）、葡萄糖25 g，蛋白胨10 g，硫酸镁1.5 g，磷酸二氢钾1.2 g，磷酸氢二钾1.8 g，维生素B115 mg，维生素B610 mg，用水定容至1000 mL，并用10%硫酸溶液将pH调至6.5。

栽培蛹虫草培养基：大米30 g，营养液40 mL。营养液配方：黄豆50 g，全脂奶粉25 g，5%硫酸镁50 mL，11% 磷酸二氢钾 50 mL，0.2%VB150 mL，0.2%VB650 mL，加水定容至5000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 碳、氮单因素比较试验

碳源试验：将液体基础培养基中的葡萄糖替换为供试碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖），其他成分含量不变，每种碳源浓度均为10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L，处理3次重复。按试验设计将配制好的液体培养基以100 mL/瓶分装，高温高压灭菌后在无菌环境下冷却至室温。无菌条件下接入100 μL菌种，22～24℃，转速为160 r/min的摇床上摇培5～6 d。

氮源试验：将液体基础培养基中的蛋白胨替换为供试氮源（硫酸铵、蛋白胨、酵母粉、尿素），其他成分含量不变，每种氮源浓度均为6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L，每个处理3次重复。接种、培养等同碳源试验。

1.2.2 液体菌种应用试验

配制的栽培蛹虫草固体培养基，高温高压灭菌后在无菌环境下冷却至室温，将1.2.1中培养好的液体菌种用高速分散均质机打碎，稀释5倍后用无菌喷枪均匀喷洒培养基上，每个培养盒15 mL，每种处理对应50盒（50个重复）。温度19～23℃、空气相对湿度50%～60%的避光培养7～8 d，待大米培养基表面布满白色菌丝并见底部有扎根现象后，在温度20～23℃、空气相对湿度为 50%～60%、光照培养45 d。摘取蛹虫草子实体，称量（每盒鲜重）。

1.3 测定方法

1.3.1 液体菌种培养及菌丝干重测定

按1.2.1中所述方法培养液体菌种，培养结束以1500 r/min离心15 min，收集菌丝球，用蒸馏水冲洗2～3次，将菌丝球放至已烘干称重的培养皿中，在80℃下烘干至恒重。每个处理3个重复。

1.3.2 虫草多糖的提取与测定

（1）多糖提取：选用超声波-酶法提取[11]虫草粗多糖。

（2）Sevag法脱蛋白：将上步提取获得的虫草粗多糖加适量蒸馏水溶解，加入溶液1/5体积的Sevag试剂（氯仿∶正丁醇体积比为4∶1），用磁力搅拌器搅拌30 min，离心（7500 r/min），弃去中间变性蛋白及下层有机相，得到多糖溶液并定容至100 mL容量瓶中待测。

（3）多糖含量的测定：以苯酚-硫酸法[12]测定蛹虫草子实体中多糖含量。

试验所得葡萄糖标准曲线方程为：y=0.0095x+0.1157，R2=0.9993。取0.5 mL多糖待测溶液，加蒸馏水补至1 mL，按照测定葡萄糖吸光度步骤操作进行吸光度测定并计算多糖百分含量。

2 结果与分析

2.1 碳源试验结果

由图1可见，碳源为蔗糖和葡萄糖的培养基培养的蛹虫草菌丝干重显著高于麦芽糖和乳糖为碳源（P＜0.05）的菌丝干重，并且在蔗糖浓度为30 g/L时，菌丝干重最高，为1.01 g/100 mL。

蔗糖浓度为25 g/L和30 g/L时的菌丝干重均显著高于浓度为10 g/L和20 g/L（P＞0.05），其他三种碳源不同浓度间菌丝干重无明显差异。

由此可知，蔗糖浓度25～30 g/L最适蛹虫草菌丝生长。蛹虫草菌丝体对蔗糖利用率较高，葡萄糖次之。

图1 碳源试验菌丝干重测定结果

2.2 氮源试验结果

蛹虫草自身合成蛋白质及核酸需要氮源，菌丝生长对氮源的利用有很大的选择性[18]。由图2可见，在硫酸铵、酵母粉、蛋白胨的液体培养基中蛹虫草菌丝能够生长，尿素为氮源的液体培养基中无菌丝生长，说明蛹虫草对氮源有选择性。

由图2可见，酵母粉作为氮源，供试浓度菌丝干重都显著高于氮源硫酸铵（P＜0.05），在其浓度为6 g/L、8 g/L、12 g/L时，菌丝干重显著高于氮源蛋白胨；酵母粉浓度为6 g/L时菌丝干重最高，为1.11 g/100 mL，其次是蛋白胨，在浓度为6 g/L、8 g/L、10 g/L时的菌丝干重显著高于氮源硫酸铵。

图2 氮源试验菌丝干重测定结果

2.3 栽培试验结果

2.3.1 不同碳源培养基培养液体菌种对蛹虫草子实体产量影响

由图3可知：添加蔗糖培养的液体菌种的蛹虫草产量显著高于添加麦芽糖和乳糖（P＜0.05），蔗糖浓度为20 g/L和30 g/L时培养液体菌种的蛹虫草产量显著高于葡萄糖，蔗糖与麦芽糖培养液体菌种的蛹虫草产量差异不显著。

碳源为蔗糖，浓度为20 g/L培养液体菌种蛹虫草产量最高，平均鲜重24.46 g/瓶，与蔗糖浓度为30 g/L时的蛹虫草产量差异显著。由此可知，不同碳源培养蛹虫草液体菌种对其子实体产量有很大影响，液体培养基中添加20 g/L蔗糖培养液体菌种接种栽培效果最好。

图3 不同碳源培养液体菌种对蛹虫草产量的影响

2.3.2 不同氮源培养基培养液体菌种对蛹虫草子实体产量影响

尿素作为氮源时没有培养出液体菌种，未做栽培试验。由图4可见，在氮源浓度为8 g/L、10 g/L、12 g/L时，添加硫酸铵培养的液体菌种栽培所得蛹虫草产量显著高于酵母粉（P＜0.05）；在氮源浓度为6 g/L、10 g/L时，硫酸铵所培养液体菌种栽培蛹虫草鲜重显著高于蛋白胨（P＜0.05），以培养基中硫酸铵用量10 g/L培养菌种的蛹虫草产量最高，平均鲜重达到25.6 g/瓶。无机氮有利于酵母状细胞的合成，这可能是液体培养基以硫酸铵为氮源培养液体菌种的蛹虫草产量高于蛋白胨和酵母粉的原因。

图4 不同氮源培养液体菌种对蛹虫草产量的影响

同一氮源不同浓度处理间蛹虫草产量差异不显著。

2.4 不同碳氮源培养液体菌种栽培蛹虫草多糖含量影响

2.4.1 不同碳源培养液体菌种栽培蛹虫草多糖含量

从图5中可以看出：在碳氮源浓度为25 g/L时，以乳糖和葡萄糖作为碳源培育液体菌种的蛹虫草子实体的多糖含量显著高于蔗糖和麦芽糖（P＜0.05）；以葡萄糖为碳源，浓度为10 g/L时所培养的液体菌种培育出的蛹虫草多糖含量最高为1.81 g/100 g，其次乳糖为碳源。

同一碳源其不同浓度蛹虫草多糖含量差异不显著。

图5 不同碳源培养液体菌种栽培蛹虫草多糖含量

2.4.2 不同氮源培养液体菌种栽培蛹虫草多糖含量

由图6中可以看出：在氮源浓度为12 g/L和14 g/L时，蛋白胨为氮源培养液体菌种的蛹虫草多糖含量显著高于硫酸铵和酵母粉，并且在浓度为12 g/L时蛹虫草多糖含量最高为1.91 g/100 g。可见培养蛹虫草子实体液体培养基中添加12 g/L的蛋白胨有利于提高蛹虫草多糖含量。

图6 不同氮源培养液体菌种栽培蛹虫草多糖含量

3 小结与讨论

试验结果表明，培养蛹虫草液体菌种最适碳源为蔗糖，葡萄糖次之，该结果与徐庆国[13]、邹湘月等[14]最适碳源研究结果一致，说明小分子可溶性糖类更容易被蛹虫草菌丝和细胞吸收利用，从而充分促进了菌丝生长及代谢；宋好倩等[15]试验得出蛹虫草液体菌种培养的最适氮源为1%的酵母粉，其次是蛋白胨，与笔者试验不同氮源培养液体菌种结果基本一致。杨宣华[16]研究得出黄豆粉作为氮源菌球数量最多，蛋白胨次之。由此可见，蛹虫草液体菌种培养基的氮源并不单一。

杨宣华[16]在栽培蛹虫草培养基中添加蛋白胨可获高产，试验在液体菌种培养基中添加10 g/L硫酸铵，培养液体菌种接种栽培获得高产。

王永敏等[17]得出以蔗糖为碳源的液体菌丝多糖得率最高，最低为乳糖；王飞等[18]在液体发酵培养基添加蔗糖，蛋白胨所得液体菌液多糖含量最高。试验测定了不同碳氮源培养液体菌种栽培蛹虫草子实体多糖，得出以葡萄糖作为碳源，以蛋白胨作为氮源所培养的液体菌种栽培蛹虫草子实体多糖含量高。由此看出，无论是培养菌丝还是蛹虫草子实体，以蛋白胨作为氮源都可以促进蛹虫草多糖的合成。

钟思敏[19]等得出以蛋白胨为氮源还可提高菌丝中虫草素含量，由此可知，培养基添加碳氮源对蛹虫草菌丝或子实体的有效成分的积累有着重要的影响，而试验只测定了蛹虫草子实体多糖，其他有效成分如虫草素、虫草酸等还需进一步研究。