基于桑树冬芽的多倍体诱导与初步鉴定

刘岩，林天宝，朱燕，吕志强

(浙江省农业科学院 蚕桑研究所，浙江 杭州 310021)

染色体是决定生物个体性状的基因载体，染色体加倍后，植物形态、生理、遗传会发生变化，往往具有器官的巨大性和抗逆性，产量和有效成分增加等[1]。在自然界，多倍体也是一种常见的生物学现象，在植物进化中起重要作用，约70%的被子植物具有多倍体的发生。多倍体育种也成为改善植物性状、选育经济性状优良新品种的有效方法之一。

桑树(MorusL.)是多年生落叶木本植物，与蚕业发展密切相关，其经济、生态和药用价值较高，地理分布广泛。长期以来，桑树主要作为家蚕饲料利用，因而增加桑叶产量、改善桑叶品质，可直接影响养蚕收成和茧丝绸行业的经济效益，也是选育和栽培桑树优良新品种的主要目标。然而，传统的桑树杂交育种周期长、靶向性低，使得新品种的培育效率低。与大多数高等植物一样，桑树多倍体具有较好的桑叶性状和经济产量，引起桑树育种者的极大关注[2]。目前，桑树多倍体育种研究大多是以杂交桑种子萌发的实生幼苗或栽培桑树器官部位为材料，多采用离体培养人工诱导多倍体，但该方法操作繁琐、耗时长、且成功率不高。

本研究尝试以田间植株为材料，利用化学诱变方法，筛选染色体数目加倍材料，以期为研究桑树的多倍化特征提供有价值的实验材料，丰富种质资源，并进一步推动蚕桑产业发展。

1 材料与方法

1.1 材料

实验桑树栽种于浙江省农业科学院科研基地。选取生长健康、无病虫害的冬芽为供试材料。

1.2 方法

1.2.1 处理条件及分组

采用多倍体诱导方法对二倍体桑树冬芽进行处理。挑选饱满待萌发的冬芽40个枝条，分为4组，每组10根枝条，分别记作对照Con、处理组1(1～10号)、处理组2(11～20号)、处理组3(21～30号)。其中，处理组1试剂为每100 mL含秋水仙碱0.1 g，6-BA 0.2 mg，浓度为95%乙醇4 mL；处理组2每100 mL含秋水仙碱0.2 g，6-BA 0.2 mg，浓度为95%乙醇4 mL；处理组3每100 mL含秋水仙碱0.2 g，DMSO 5 mL，浓度为95%乙醇4 mL；对照为无菌水。

处理方法为每天上午8：00，将现配混合均匀的各制剂用微量注射器从桑树冬芽芽尖注射至有液珠从冬芽渗出为止。每隔3 d处理1次，共处理4次。

1.2.2 表型观测

每天观察处理后的冬芽生长情况，记录冬芽脱苞后，新生叶片呈现出肉眼可见的卷曲畸变、新生枝条节间距缩短表型变化。

1.2.3 流式细胞仪

参照文献方法，取约1 cm2的新鲜嫩叶(未完全展开叶片)，平放在载玻片上，加入1 mL解离液(10 mmol·L-1MgSO4，50 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1HEPES，0.25% TritonX-100，1% PVP 40，pH值7.5)，经300目细胞筛过滤后，上清液转移至1.5 mL离心管，在4 ℃条件下1 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液加入适量PI染色液、RNAase避光作用30 min。以上操作均在冰上进行。处理后用Partec CyFlow ML流式细胞仪测试。同时，以二倍体农桑14号、三倍体桑树(丰田2号，大中华)、四倍体桑树(桂诱5号)的组织细胞样品作为参照。

2 结果与分析

2.1 对桑芽生长的影响

经过秋水仙碱处理后，冬芽生长缓慢，叶片出现畸形。随着秋水仙碱浓度的增加，不定芽的发育受阻率增加，生长受到严重抑制。存活芽顶部干枯，出现生长点分裂、新生叶片皱缩变形、茎节粗、节间密(图1)。

图1 多倍体诱导冬芽的处理早期生长观察

2.2 多倍体诱导枝条的生长

处理后40 d，处理芽萌发枝条出现典型的叶型扭曲畸变、节间稠密、叶色变深等表现。随着生长时间的延长，早期不同秋水仙碱浓度对植物的毒害差异逐渐减小，此时观察到含6-BA的0.2%秋水仙碱的2号处理组诱导出畸形枝条表现率较高(图2)，提示我们秋水仙碱浓度过高或过低都会影响到诱导率。

图2 诱导处理后桑枝的生长表现

2.3 染色体倍性检测结果

取已知倍性的农桑14号(二倍体)、丰田2号和大中华(三倍体)、桂诱5号(四倍体)桑树嫩叶，制作标本在流式细胞仪下测定倍性，荧光通道值检测结果显示:二倍体农桑荧光通道值为100，三倍体通道值主要集中在150，这在丰田2号和大中华中有相似表现；而在四倍体对照样品桂诱5号中，检测的荧光通道值主要集中在200，说明我们的检测方法稳定可靠。取处理的30个样品分别检测，发现其中的3个处理17号、18号和21号呈现出与二倍体对照有差异的染色体图形。这三组样品中，200位置的通道值明显高于对照组(图3)。提示我们实验样品可能有混倍体的表型。

3 讨论

多倍体育种是植物高产优质育种的重要途径之一，在蔬菜、林木、果树中应用较广[3-7]。但不同植物由于处理的条件、方法不同，诱变多倍体的效果也有差异。本实验中，选用田间冬芽为材料，直接采用微量多次注射的方法，相对缩短了多倍体的育种周期，为后续进一步纯化和今后的生产应用奠定基础。

秋水仙碱溶液的浓度目前是凭经验，多数研究总结出0.2%常用浓度。具体实施中，仍需要以该浓度为中心，多设置浓度梯度，保证多倍体植株的诱导成功率[6]。但过高或过低的浓度都不利于多倍体的诱导产生，这可能与秋水仙碱的毒害作用有关，与王茜龄等[6]研究报道一致。提示我们实验中应该设置更多的浓度范围以摸索更合适的工作条件。

如何鉴别多倍体一直存在争议。形态观察是最简单直观、也最粗放的倍性鉴定方法，但假阳性率极高。本研究利用不同浓度的秋水仙碱诱导处理，

图3 流式细胞仪检测染色体倍性

检测获得生长异常枝条，染色体呈现二倍、四倍混合显示。分析可能使处理是部分细胞受到影响，从而形成嵌合体。本研究利用不同浓度的秋水仙碱诱导处理，检测获得生长异常枝条，染色体呈现二倍、四倍混合显示。分析可能是处理使部分细胞受到影响，随着细胞的进一步生长，多倍体细胞、原二倍体细胞同时生长，所以检测样品中出现混倍体表现。但彭绿春等[8]在检测腋花杜鹃多倍体时也提出，有的变异样品中，植物荧光通道值也会出现在50、100位置同时出现峰。而有些表型显示变异的植株，其染色体检测却呈现出与二倍体一样的50荧光通道值。由此提出流式细胞仪检测方法更准确、和假多倍体植株的概念。后续为获得纯化多倍体植株，还需要根据不同类型的表型变异与倍性增加的相关性，进一步纯化和稳定多倍体表征。譬如对嵌合率高的叶片肥厚和叶片畸形扭曲的变异材料，通过诱导不定芽等方式，分离纯化四倍体。

总之，本研究是早期快速鉴定倍性方法，可有效降低工作量，为生产提供参考及鉴定依据。为新种质创造提供技术支持，对拓宽桑树遗传背景、丰富种质资源类型等也具有重要的现实意义。