补肾活血方对骨质疏松症大鼠Smurf1信号转导蛋白的影响

石树培，陈 鹏，林海仙，刘蔚楠，朱 玮，韩 海，郑春盛，杨 直

（福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨量减少以及骨组织微细结构退变为特征，伴有骨脆性增加以及骨折风险增高的一种全身性的骨骼疾病［1］。随着我国逐渐步入老龄化社会，骨质疏松症的发病率也逐年上升，目前已成为老年人常见疾病之一。骨质疏松症的致病原因有多种，包括年龄、内分泌的紊乱、钙平衡的失调、免疫、营养、遗传等，其致病机制主要和骨代谢失调相关。祖国医学认为骨质疏松症主要以肾虚血瘀证为多见［2-3］。因此，临床上以补肾壮骨、活血化瘀，辅以调补脾肾、补益肝肾治疗［4］。本研究基于泛素蛋白酶体复合通路（UPP）以及TGF-β／Smads通路，通过研究Smad泛素调节因子1（Smurf1）在用药前后的蛋白表达量变化，来探讨补肾活血方治疗骨质疏松症大鼠的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 选用4～5月龄雌性SD大鼠60只，体质量（200±50）g，未曾交配，购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002，饲养于福建省骨科研究所。

1.2 实验药物 补肾活血方药物组成：熟地黄24 g，巴戟天 9 g，续断 9 g，桑寄生 9 g，龟板 15 g，黄芪 15 g，白术 9 g，大枣 9 g，丹参 12 g，当归 12 g，杜仲 9 g，甘草3 g。常规水煎制，含药量为0.912 g／mL。戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司广州分公司），使用时将药片研磨后用超纯水配成浓度为0.016 mg／mL。

1.3 实验试剂 兔抗大鼠Smurf1一抗（美国Invitrogen公司，Cat：387900）；HRP 羊抗兔二抗（美国Jackson公司）；ECL化学发光检测试剂盒（美国Thermo Fisher公司）；水合氯醛注射液（国药集团化学试剂有限公司）；TKaRa RNAPCR Kit（AMV）Ver.3.0 试剂盒、DNA Marker DL2000（TaKaRa大连宝生物公司）；Smurf1引物（由TaKaRa大连宝生物公司合成）；甲醇（分析纯，西陇科学股份有限公司）；无水乙醇（分析纯，山东利尔康消毒科技有限公司）。

1.4 实验仪器 Milli-pore超纯水系统（德国Millipore公司）；Thermo超低温冰箱（美国Thermo公司）；蔡司Axio Observer倒置荧光显微镜（德国Carl Zeiss公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；高压蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；Fluor Chem R多功能成像分析系统（美国Protein Simple公司）。

2 实验方法

2.1 造模和分组 先将64只大鼠随机分正常组12只、假手术组12只及造模组40只。除正常组外，其余大鼠用10%水合氯醛（0.25 mL／100 g）腹腔注射麻醉。麻醉后，于大鼠最末肋骨下，从腋中线和距腰背部脊柱外侧1 cm作纵行切口，逐层切开皮肤及肌肉，结扎输卵管，将卵巢完整摘除，同法切除另一侧卵巢。两侧卵巢组织切除后，逐层缝合并关闭创口。而假手术组只行切口切开，但并不切除卵巢组织，仅切除卵巢周围少许的脂肪组织，随后逐层缝合。术后3个月，造模组死亡4只，将造模组按体质量随机分为空白模型组、戊酸雌二醇组和补肾活血方组，每组各12只。

2.2 干预 补肾活血方组按9.12 mg／（kg·d）予补肾活血方水煎液灌胃，戊酸雌二醇组按 0.16 mg／（kg·d）予戊酸雌二醇药液灌胃，正常组、假手术组、空白模型组予等体积纯净水灌胃。每日上午灌胃1次，连续灌胃6 d，休息1 d后，再继续灌胃，连续干预12周。实验期间，各组大鼠每周进行称重1次，并根据体质量变化每周调整给药剂量。实验大鼠在最后一次给药后，予以禁食24 h，麻醉后对手术部位进行消毒，并采集标本。

2.3 Smurf1 mRNA在大鼠肾组织中的RT-PCR检测 取一侧肾皮质约50～100 g，将其放入装有1 mL TRIzol的Ep管内，按照说明书提取总RNA。根据大鼠Smurf1 cDNA序列，设计合成了扩增Smurf1 cDNA片段的特异性引物。Smurf1：上游5’-GTTGAG CGAGCAAGTGA-3’，下游 5’-TGGGAGGAAAGGC ATC-3’，扩增的基因片段长度为377 bp。

2.4 Smurf1在肾组织中的Western blot检测 取大鼠的肾组织块250 mg，将其在液氮中碾成粉末，并加入1 mL已经预冷的组织裂解液，用匀浆机于冰浴中匀浆2 min后，在4℃下14 000 r／min，离心1 h，取上清液并于4℃保存备用。进行总蛋白的定量、SDS-PAGE电泳、蛋白的转膜以及膜的封闭，最后通过ECL试剂盒进行化学发光显色。

2.5 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行数据统计。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 5组大鼠肾脏组织Smurf1 mRNA表达比较见图1。

图1 5组大鼠肾脏组织Smurf1凝胶电泳图

3.2 5组大鼠肾脏组织Smurf1蛋白表达比较 见图 2、图 3。

4 讨 论

图2 5组大鼠肾脏组织smurf1蛋白电泳图

图3 5组大鼠肾脏组织Smurf1蛋白灰度值比较

根据骨质疏松的特点，应属祖国医学中的“骨枯”“骨痿”范畴。中医学认为肾主骨、藏精、生髓，为先天之本，早在黄帝内经《素问·痿论》中记载：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”，《黄帝内经》指出：“骨不生，则髓不能满”“骨者，髓之府，不能久立，行则振掉，骨将惫矣”均阐述了肾与骨、髓之间的联系。肾精充足，则骨有生气，相反，若肾精肾气不足，则诸骨皆枯，导致全身的骨量降低，易发生骨折及疼痛。因此，肾虚当为骨质疏松重要的一个病因。清代医学家王清任在《医林改错》提出：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而为瘀”，血瘀则是发病机理中的必然产物。基于此，根据“肾虚血瘀”的理论，治疗上采用标本兼治为法则，补肾为主，辅以活血化瘀。

补肾活血方中熟地黄、龟板滋阴益髓、养血补精，为君药；巴戟天、续断、桑寄生、杜仲补益肝肾，强筋健骨，祛风除湿，为臣药；丹参、当归活血补血，黄芪、白术益气健脾，共为佐药；大枣、甘草益气补血，缓急止痛，调和诸药，为使药。诸药合用，共奏补肾活血、填精益髓之效。

骨代谢的过程包括骨吸收和骨形成，其过程受到许多生长因子、转录因子以及信号转导分子等的调节。其中TGF超家族中的转化生长因子β（TGF-β）对骨细胞的增殖、分化与凋亡起着重要作用［5］，其不仅能够刺激骨细胞的DNA表达与重组、胶原的合成，对多种细胞活性与促细胞生长起作用，同时还可抑制破骨细胞的生成以及成熟破骨细胞的活性，进而抑制骨吸收。因此，可通过研究UPP调节骨转化生长因子和其信号通路，来进一步研究骨质疏松症的内在机制。

Smad通路是目前公认的可介导TGF超家族细胞内反应的主要通路。TGF-β／Smad通路是介导TGF超家族的细胞外信号跨膜传递到细胞核内的重要通路。1999年，随着降解R-Smads的泛素连接酶的被发现，人们发现了泛素-蛋白水解酶复合体通路可以调控Smads的降解，进而证明了Smad通路的关闭与调节可通UPP来实现［6］。由于TGF-β／Smad通路对于骨代谢过程具有重要的信号转导调节作用，而UPP又可调节TGF-β／Smad通路，因此UPP对于TGF-β／Smad通路的异常介导可影响骨的代谢，所以本实验以UPP中的泛素连接酶Smurf1为主要研究对象。

本研究结果显示，正常雌性大鼠的肾脏中可表达Smurf1，切除卵巢后，体内雌激素分泌可明显降低，使得TGF-β／Smad信号通路的降解出现了异常，最终导致了骨代谢异常及骨质疏松症的出现。当给予补肾活血方制剂及戊酸雌二醇后，肾脏组织中的Smurf1蛋白的表达量均有显著的上升。因此，补肾活血方具有改善Smurf1蛋白表达的作用，从而具有治疗骨质疏松的作用。虽然Smurf1是蛋白质降解的重要因素，但其机理目前还不十分清楚。同时，机体是一个复杂的系统，各种因子对于骨代谢调节的相互关系又十分复杂，因此，Smurf1对于骨代谢相关因子的调节仍需进一步的研究。