基于液质联用的川芎嗪对人THP-1细胞干预作用的代谢组学研究

李续博，姜广宇，董 航，赵 旭*

（1.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院脑外科，黑龙江 佳木斯 154002；3.佳木斯大学附属第一医院血液科，黑龙江 佳木斯 154002）

急性髓系白血病（acute myeloidleukemia，AML）的发生与患者体内造血干细胞的恶性克隆导致早期原始细胞大量增殖，分化凋亡障碍有关。目前，临床上预防和治疗髓外白血病的方法主要是加大化疗剂量或联合放疗，作用机理是使化疗药物透过血脑屏障、血睾屏障直接杀伤肿瘤细胞，但其毒副作用突出，严重影响肿瘤患者的生存质量。从白血病细胞浸润转移的机理方面考虑，寻找抑制其浸润转移的药物是目前研究的热点。已有研究报道，川芎嗪具有抑制肿瘤细胞生长、逆转肿瘤细胞多药耐药、化疗增效与减毒、放射增敏与放射保护以及调节免疫等作用[1-4]。

我国传统中药川芎嗪具有多方面的抗肿瘤活性，这是众多化疗药物所不能及的，新近研究表明川芎嗪可以抑制实体肿瘤的侵袭转移，且已有研究结果已经证明川芎嗪可以有效的抑制HL-60 细胞的粘附和侵袭能力[5-13]。因此，本实验采用代谢组学技术靶向探究人THP-1 细胞的代谢机制，明确核心靶标。同时基于代谢水平评价川芎嗪的药效，为揭示急性髓系白血病的发病机制和川芎嗪的作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Q-Exactive 超高分辨质谱仪（美国Thermo 公司）；XS104 /204/205DU 分析天平（美国梅特勒-托利多）；MPC-P25 微孔板迷你离心机（中国奥盛仪器有限公司）；MIX-2500 迷你混合仪（中国佑宁仪器有限公司）；测定仪台式快速离心浓缩干燥器（中国亚欧德鹏科技有限公司）；25 cm2斜颈细胞培养瓶（中国信裕生物科技有限公司）；Biosafer-40TD 纯水机（中国赛飞公司）。胎牛血清、McCoy's 5A 液体培养基、DMEM（中国联硕生物科技有限公司）高糖培养液。THP-1 细胞（上海纪宁JN-B1139），川芎嗪（赫澎生物上海科技有限公司20161025）。

1.2 细胞培养 THP-1 细胞采用McCoy's 5A 培养液在37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞融合率达70%～80%时传代。将THP-1 细胞以每孔2×106接种于6 孔细胞培养板，将6 孔板细胞分为空白组（加入等体积的细胞培养液），川芎嗪组（加入含川芎嗪浓度2.5 μg/L 培养液1 mL），实验组每组各重复6 个平行孔。

1.3 细胞提取方法 取对数期生长的细胞，弃去培养基，以生理盐水清洗细胞3 遍，液氮淬灭后加入1.5 mL的甲醇-水（4：1，v/v）溶液，细胞刮刀取下细胞，并置入1.5 mL 离心管中涡旋，超声破碎细胞。细胞破碎后离心（4℃、4 000 r/min、15 min）。取上清液氮气吹干，100 μL 的0.1%甲酸复溶。

1.4 分析条件 色谱柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm）（Waters集团公司，美国）；流动相：A 为0.13%甲酸-水，B 为0.1%甲酸-乙腈；柱温：40 ℃；流速：0.4 mL/min；进样量：3 μL；梯度洗脱方法见表1。离子喷雾电压：5.5KV；离子源温度：600 ℃；解簇电压（DP）：100V；碰撞能量（CE）：35 eV。氮气为雾化气和辅助气：雾化气55 psi，辅助气55 psi，气帘气35 psi。m/z 在100 ～1200 amu 质量范围进行全扫描，积累时间250 ms。IDA 采用标准：每个分析物，超过100 cps 的8 个最强的碎片离子在100 ～1200 amu 质量范围内进行子离子扫描，累积时间为100 ms。碰撞电压差为15 eV，动态背景扣除DBS 开启。自动校准系统（CDS）对MS 和MS/MS 自动进行调节和校正。

表1 大鼠尿液样品UPLC 流动相梯度洗脱方法

1.5 数据处理及生物标记物鉴定 原始数据通过代谢组学权威在线分析系统XCMS-Online 进行数据预处理，之后将包含质合比、强度、保留时间的数据包导入SIMCA 11.5 用于模式识别，结合偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结果对分组贡献率大的内源性小分子代谢产物。最终通过Metline（http://metlin.scripps.edu）、HMDB（http://www.hmdb.ca）、KEGG（https://www.kegg.jp）等数据库进行检索和比对以鉴定生物标记物。

2 结果

2.1 代谢组学研究 通过降维处理得到影响代谢分布的主成分分析示意图，由图1可知，空白组、模型组和给药组的组内聚类良好，组间分离明显。空白组和模型组组间分离明显，证明2组细胞内的代谢产物具有极大差异，可能由于人THP-1 细胞的异常代谢导致，经川芎嗪治疗后呈部分回调趋势，处于空白组和模型组之间，通过代谢分布可知川芎嗪对人THP-1 细胞有很好的治疗作用；经OPLS-DA 筛选空白组和模型组组间对分组具有显著性贡献的小分子代谢产物作为潜在生物标记物，共鉴定6 个潜在生物标记物（表2），并根据构建代谢通路图（图2）及代谢通路分析（表3）。

图1 人THP-1 细胞主成分得分图

图2 人THP-1 细胞代谢通路图

表2 人白血病THP-1 细胞生物标记物

表3 人白血病THP-1 细胞代谢通路分析

3 讨论

苯丙氨酸是所有哺乳动物的必需氨基酸，其膳食摄入量对蛋白质生物合成至关重要。苯丙氨酸可以通过羟基化代谢成酪氨酸。我们的结果显示，人THP-1细胞的苯丙氨酸和酪氨酸的水平显著高于空白组；苯丙氨酸的水平远大于酪氨酸。这意味着在癌症负荷下，来自宿主的蛋白质的降解也得到增强，这是由显著降低的血清白蛋白水平所支持的，以产生糖异生和分解代谢所需的氨基酸来供给TCA 循环。

谷氨酰胺不是一种必需氨基酸，但具有多种生理功能。它是体内的氮载体，是快速增殖的细胞主要燃料来源，如淋巴细胞、单核细胞和肿瘤细胞等。谷氨酰胺可以转化为葡萄糖作为能源，也可用于嘌呤和嘧啶的生物合成，作为DNA 和RNA 生物合成的构建块。在正常状态下，细胞内的谷氨酰胺保持在一个相当恒定的水平。在癌症患者中，快速增殖的肿瘤细胞是谷氨酰胺的主要消耗者，并且随着疾病的进展，宿主血液中谷氨酰胺逐渐耗尽。本次研究发现人THP-1 细胞内谷氨酰胺含量下降与先前对其他类型癌症的观察结果一致。

胆碱在与细胞膜相关的磷脂代谢中起着重要的作用，并且在肿瘤细胞体外和体内NMR 研究中发现磷酸胆碱的升高以及总胆碱含代谢物升高。这被认为是癌症中胆碱磷脂代谢异常的一个特征。在这项研究中观察到的胞内胆碱的低水平可能是由于白血病细胞增殖过程中胆碱及其衍生物的过度需求所致。

本研究通过代谢组学技术全局分析人THP-1 细胞的代谢，通过模式分析获得6 个生物标记物可能与急性髓系白血病的发病密切相关，可为临床诊断及急性髓系白血病的机制研究提供实验基础。