BC200通过介导脑胶质瘤细胞干性的维持抑制替莫唑胺的促凋亡作用

童民锋，杨帆，刘继红，徐虎

（金华市中心医院 神经外科，浙江 金华 321000）

脑胶质瘤是常见的颅内原发性恶性肿瘤，因其具有高度恶性生物学行为，临床治疗效果往往不佳[1]。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是一种亲脂性小分子，能高效透过血脑屏障，引起碱基错配导致DNA断裂进而抑制肿瘤细胞生长最终导致细胞死亡，为胶质瘤治疗的一线化疗药[2]。越来越多研究发现，肿瘤内存在一部分具有自我更新能力、多向分化潜能及更强体内成瘤能力的细胞—肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）[3]。研究报道，脑胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs）是脑胶质瘤对包括TMZ在内的传统化疗耐受的重要因素[4]。如何遏制脑胶质瘤对化疗药物耐受是临床治疗的关键所在。长链非编码RNA（lncRNA）是转录长度在200 nt～100 kb的非编码RNA，许多lncRNA异常表达于肿瘤，并且影响包括脑胶质瘤在内的多种恶性肿瘤发生发展[5]。lncRNA BC200（以下简称BC200）是lncRNA大家族的一员，临床研究显示其在高侵袭性乳腺癌及卵巢癌、宫颈癌中高度上调[6]，但BC200与脑胶质瘤干性的关系还未有研究报道。本研究以脑胶质瘤U87 MG细胞为研究模型培养分离GSCs，siRNA干扰BC200并观察GSCs对TMZ的敏感性，为临床脑胶质瘤治疗提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料 U87 MG胶质瘤细胞系购自中国科学院上海细胞库。DMEM和无血清干细胞培养基DMEM购自美国Invitrogen公司；EGF、bFGF和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；羊抗兔CD133、羊抗鼠Bax、羊抗鼠Bcl-2和羊抗鼠cleaved caspase-3、羊抗兔GAPDH购自美国Cell Signaling公司；辣根过氧化酶标记的鼠和兔二抗购自美国Bioworld公司；蛋白提取试剂盒及细胞裂解液购自北京碧云天公司；BC200 siRNA购自上海吉玛公司；TMZ购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、GSCs提取及TMZ处理:U87 MG细胞先以含10% FBS的DMEM培养基于培养瓶中培养，后转至无血清的神经干细胞培养液含重组碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）20 pg·L-1和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）20 pg·L-1中，并加入B27补充剂培养提取GSCs，GSCs以球形悬浮状态生长。细胞均在37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱内培养传代。以TMZ（200 μmol·L-1）处理GSCs 24 h进行后续实验。

1.2.2 免疫荧光鉴定GSCs:GSCs在4%多聚甲醛中固定30 min后，室温下用Triton X-100透核膜10 min。应用含5% BSA的PBS封闭2 h，于4 ℃下孵育一抗CD133（1:400）和Nestin（1:500）过夜，同时以DAPI染核。室温孵育荧光二抗2 h，PBS洗片后应用荧光显微镜观察拍照。

1.2.3 siRNA转染:转染前1 d，用0.5 mL含FBS和抗生素的DMEM培养基将细胞接种在24孔板上。选择用于初期接种的细胞数量，应能在24 h内使细胞汇合达到70%～90%。转染前换成无抗生素、无血清的培养基。siRNA的转染浓度为40 pmol/L，准备siRNA-lipo 2000混和液，稀释转染试剂Lipofectamine 2000（lipo 2000），使用前将lipo 2000试剂摇匀，然后取适量，用不含血清的培养基稀释，轻轻混和，室温孵育5 min；用不含血清的培养基稀释siRNA，加入量为40 pmol/L，轻轻混和；稀释好的lipo 2000 经过5 min的孵育后，与稀释好的siRNA轻轻混和，室温20 min以形成siRNA-lipo 2000混和物。将siRNA-lipo 2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中轻轻摇晃，使之混匀。将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中至检测时间24 h。设立转染对照组（NCsi）和BC200转染沉默组（BC200 siRNA）。

1.2.4 Western blot:细胞培养融合至70%，按实验要求处理细胞后，加入RIPA细胞裂解液（使用前20 min加蛋白酶抑制剂，使其终浓度为1 mmol·L-1），在冰上孵育15 min以充分裂解，然后在4 ℃、12 000 r/min离心15 min。取样品上清液留用，采用BCA试剂盒进行蛋白定量。进行Western blot检测时，每个泳道按30 μg蛋白质样品进行上样，SDSPAGE电泳分离蛋白，然后将分离蛋白电转移至硝酸纤维素膜（美国Millipore公司）上；5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，以TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；然后按要求加入Bax（1:1 000）、cleaved caspase-3（1:1 000）、Bcl-2（1:2 000）、CD133（1:1 000）室温杂交1～2 h或4 ℃温育过夜。一抗处理后，TBST洗膜3次，再加入相应的辣根过氧化物酶标记二抗（1:2 000），室温杂交1 h，PVDF膜以化学发光试剂盒（美国Millipore公司）进行显色，Syngene Imaging System进行成像，以Quantity One对蛋白印迹条带进行处理和分析。

1.2.5 实验分组:实验分为对照组（Control组）、TMZ处理组（TMZ组）、转染对照组（NCsi组）、BC200转染组（BC200 siRNA组）、TMZ处理的NCsi组（NCsi+TMZ组）、TMZ处理的BC200 siRNA组（BC200 siRNA+TMZ组）。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS11.5软件进行分析。数据以±s 表示，2组间比较用两独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSCs的分离鉴定结果 免疫荧光染色发现GSCs表面存在干细胞标记物CD133和Nestin，GSCs分离培养成功，见图1。

图1 GSCs表面干细胞标记物CD133和nestin的荧光显色（免疫荧光染色）

2.2 TMZ处理对GSCs凋亡的影响 TMZ处理24 h后，TMZ组24 h GSCs成球能力未有明显变化，见图2。与Control组比，TMZ组细胞Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平未有明显变化（P＞0.05）。

图2 TMZ对GSCs细胞形态无明显影响（×100）

2.3 siRNA沉默BC200对GSCs干细胞标志物表达的影响 与NCsi组比，BC200 siRNA组的BC200 RNA水平下降了90.25%±3.66%，差异有统计学意义（P＜0.01）；与NCsi组比，BC200 siRNA组的CD133蛋白表达下降92.36%±4.22%，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3。

2.4 沉默BC200对TMZ诱导的GSCs凋亡的影响 与NCsi+TMZ组比，BC200siRNA+TMZ组GSCs成球能力明显减弱，见图4A。与NCsi+TMZ组比，BC200 siRNA+TMZ组细胞cleaved caspase-3和Bax分别上调45.36%±4.25%和63.23%±5.12%，Bcl-2下调31.22%±3.80%，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4B和4C。

图3 siRNA沉默BC200后抑制GSCs CD133蛋白表达

3 讨论

图4 沉默BC200对TMZ诱导的GSCs细胞球形生长和凋亡的影响

恶性胶质瘤是常见的中枢神经系统肿瘤，具有高侵袭性。到目前为止，传统手术只能切除肉眼可见的胶质瘤病灶，因此术后患者往往要接受放疗或化疗[7]。TMZ为胶质瘤治疗的一线化疗药物，是一种能高效透过血脑屏障的亲脂性小分子，其药理机制为引起碱基错配导致DNA断裂进而抑制肿瘤细胞生长最终导致细胞死亡[2]。研究发现，经过一段时间治疗恶性胶质瘤细胞对TMZ等化疗药敏感性会降低[8]。研究报道，降低恶性肿瘤干细胞干性可增强细胞对化疗药物的敏感性[9]。肿瘤干细胞具有自我更新、无限增殖、高致瘤性等特点，近些年研究发现，肿瘤干细胞与干细胞具有某些相同的特异性表面分子标志物，例如CD133、Nestin、ESA等，且悬浮生长时均会以微球状生长[10-11]。本研究发现干细胞培养液培养分离的GSCs表面阳性表达CD133和Nestin，细胞球状聚集生长，验证了其干细胞特性。TMZ处理GSCs 24 h时细胞球状生长能力未明显下降，凋亡标志蛋白Bax、cleaved caspase-3和Bcl-2未有明显变化，提示在24h时TMZ未能明显诱导GSCs凋亡。

BC200是一种在人类神经细胞中特异性表达的lncRNA，通过特定的调节机制调节神经元细胞突触小体的形成，在一般正常组织中可以检测到较低表达量的lnc BC200[12]。研究报道，lncRNA BC200在肿瘤组织中表达量明显升高，释放并稳定地存在于血液中，这为其作为外周血肿瘤标志物提供了可能[13-14]。本研究进一步实验发现，BC200高表达于脑胶质瘤U87 MG细胞，siRNA沉默BC200后，由脑胶质瘤U87 MG细胞培养分离的GSCs干细胞标志物CD133表达下调。提示GSCs干性能力下降。TMZ处理沉默BC200的GSCs发现，细胞成球能力减弱，细胞分散生长。观察凋亡标志蛋白发现，Bax和cleaved caspase-3 表达明显上调，Bcl-2 下调。这些提示GSCs中BC200对细胞干性的维持具有重要作用，而干细胞特性的保持使GSCs能够抵抗TMZ诱导的细胞凋亡。

综上所述，BC200可能通过介导Nestin表达从而维持脑胶质瘤U87 MG细胞的干性，而该效应可促进细胞对TMZ诱导凋亡的抵抗。因此，干预BC200及其下游信号靶点可能是脑胶质瘤临床治疗的新方法。