仅女性发病的Leber遗传性视神经病变家系的表型分析

吕媛媛，徐曼，张娟娟，管敏鑫

（1.温州医科大学 检验医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属眼视光医院，浙江 温州 325027）

Leber遗传性视神经病变（Leber's hereditary optic neuropathy，LHON）是一种母系遗传病。1871年，德国眼科医师Leber首次对其临床特征作了相应描述:此病好发于青壮年男性，双眼可表现同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，可能伴随着中心视野缺失及色觉障碍[1-4]。典型的LHON首发症状是视物模糊，随后的几个月之内出现无痛性、完全或接近完全的失明。视网膜神经节细胞退行性变是LHON的主要病理特性[5]。LHON和线粒体功能异常之间存在着密切关系，线粒体DNA的突变是这种疾病的分子基础[2，6-7]。已报道，MT-ND1 3460G＞A、MT-ND1 11778G＞A和MT-ND1 14484T＞C突变存在于一些国家近90%的LHON家系当中，这3个LHON原发性位点参与编码呼吸链复合体I的亚基[2，8]。但是，LHON相关的3 个原发性突变位点（m.3460G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C）本身尚并不足以导致LHON的临床表现。这也就合理地解释了为什么在一个家系中或不同家系之间的母系亲属，尽管他们携带相同LHON相关的线粒体DNA突变，但视力损伤方面却表现出不同的严重程度、发病年龄和外显率。因此，其他的一些环境因素及遗传因素（如核基因修饰、线粒体单体型等）可能参与LHON相关的线粒体DNA突变相关的视觉损害的表型表现的调节[2-3]。此外，LHON患者家系的典型特征是男性偏倚，而本研究的11个LHON家系仅累及了母系女性成员，这些女性成员表现出LHON的临床特征。且对以上女性患者进行线粒体全基因组分析，鉴定她们的确携带线粒体ND4 11778G＞A突变。为探索其他环境因素或遗传因素对LHON表型的影响，我们进一步对所有系谱中的母系成员进行线粒体全序分析及线粒体单体型分析。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2008年5月至2014年10月温州医科大学附属眼视光医院、河北省眼科医院、北京中医药大学东方眼科医院、福建东南眼科医院等全国各地多家医院的LHON患者，采集他们的外周静脉血液并收集相应的临床资料。对收集的1 362例汉族LHON患者的MT-ND4基因进行了系统筛查，线粒体全基因组测序分析获得11位携带11778G＞A突变的LHON患者，并对患者所在家系进行进一步测序分析。本研究经温州医科大学伦理委员会批准，所有受检者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 眼科检查:对收集的系谱中的先证者及其他成员进行眼科检查，包括视力、视野、色觉检查、眼底、压力、瞳孔对光反射、视觉诱发电位、眼底成像等。根据WHO定义的视力损伤程度的标准:轻度（一级视力损伤）:0.3～0.1；中度（二级视力损伤）:0.1～0.05；重度（三级视力损伤）:0.05～0.02；极重度（四级视力损伤）:小于0.02。

1.2.2 线粒体基因组突变分析:从受检者的外周静脉血中提取基因组DNA（经典酚氯仿手工法提取），提取的基因组DNA进行浓度和纯度检测（Nano Drop 2000，美国Thermo Fisher公司）。以提取的DNA作为PCR模板，按照PCR体系加入10×PCR buffer，dNTPs，正、反向引物，Mg2+，Taq酶，ddH2O各成分并混匀，置于PCR仪进行反应。设置反应程序为:95 ℃5 min，95 ℃ 45 s，Tm 59 ℃ 45 s，72 ℃1 min/kb，35个循环，72 ℃ 8 min。

11位先证者的线粒体基因组在一套轻（L）链和重（H）链寡核苷酸引物作用下在24个重叠片段中进行PCR扩增[9]。扩增产物进一步纯化后用24对正反向引物进行线粒体基因组测序。最后，通过Codon Code序列分析软件将测得的先证者的线粒体全序列与修正的mtDNA剑桥参考序列（Cambridge reference sequence，rCRS，NC_012920.1）[10]进行对比分析。

1.2.3 线粒体单体型分析:全序分析携带11778G＞A突变的11位先证者通过线粒体单体型命名法归类到亚洲线粒体单体型[11-12]。

1.2.4 保守性分析:基因保守性是指某一段序列在进化演变的过程中，在不同的物种都一直保留。这样的基因一定发挥着很重要的功能，并且有其不可代替性。因此为分析该位点的保守性，我们使用了17个脊椎动物的线粒体DNA序列来进行种间分析，包括小鼠、人、牛、节尾狐猴、卷尾猴、白手长臂猿、大猩猩、猕猴、地中海猕猴、倭黑猩猩、猩猩、蜂猴、苏门答腊猩猩、阿拉伯狒狒、黑猩猩、马来跗猴、爪蟾。通过对比人和其他16种脊椎动物的核苷酸变异计算得出该位点的保守性。即在17种脊椎动物中该位点具有野生型核苷酸的物种的百分比。

2 结果

2.1 临床表现 先证者（WZ300-III-2、WZ327-IV-1、WZ415-IV-3、WZ883-IV-1、WZ1232-III-1、WZ1234-IV-3、WZ1245-III-1、WZ1391-III-1、WZ1420-III-1、WZ1427-III-6、WZ1448-II-3）分别在10、7、9、13、16、13、10、9、7、17、25岁时无痛性双眼视力下降，先是单侧视力下降，1～2周后对侧视力下降，中心视野缺损，色觉障碍。对先证者们分别进行眼科检查，视力损伤检测结果见表1，患者发病时的视力损伤程度由轻度到极重度不等。个别视力损伤严重的患者眼底图见图1，家系图见图2。同时我们还对先证者所在家系成员进行临床评估，先证者及其家系中患者皆为女性，发病年龄为9～26（12.4±4.8）岁；家系外显率为6.7%～25.0%，每个家系平均15.90%±0.08%；11个家系合计总的外显率为14.5%（见表2）。

表1 11例家系先证者临床资料

图1 3例患者和1名正常对照的眼底图像

图2 11例患者的家系图

表2 11例家系患者临床资料总结

进一步对11个家系中所有成员进行了全面的病史、体格检查和眼科检查，结果表明，这些家系先证者和其他成员并未表现出其他的临床异常，如糖尿病、肌肉疾病、听力障碍和神经紊乱等临床症状。因此，没有其他相关证据或机制来影响家系中患者的视力损伤。

2.2 线粒体基因组分析 母系成员视力出现障碍会让我们联想到线粒体疾病，因为线粒体疾病的遗传方式即母系遗传。因此，我们通过提取血液DNA进行线粒体24对引物PCR扩增技术来对11位先证者进行线粒体全序检测分析。首先检测LHON相关的3个原发性位点（m.3460G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C），结果发现11位先证者均携带了m.11778G＞A突变。通过对比先证者们的线粒体全序和修正的mtDNA剑桥参考序列[10]发现:在这些先证者线粒体基因的核苷酸突变中，D-loop区有44个变异；12S rRNA编码区有5个变异；16S rRNA编码区有3个变异；tRNAGln、tRNAMet、tRNAAla、tRNACys、tRNAGlu编码区各1个变异；NC非编码区1个变异；氨基酸编码区95个变异（其中同义突变69个，错义突变26个），共计153个变异位点。此外，我们还针对发现的突变位点进行保守性评估，对其他16种脊椎动物中的这些序列和变异点进行系统进化分析，进一步评估这些RNA和编码区中的变异点，通过人与其他16种脊椎动物的核苷酸变异进行比较计算出该位点的保守性指数。RNA上的变异点及保守性见表3，氨基酸编码区的错义突变位点及保守性见表4。

表3 D-loop区及RNA上变异位点总结

2.3 线粒体单倍体型分析 线粒体DNA与核基因不同，首先线粒体DNA缺乏组蛋白保护而呈现裸露的闭合双环状结构，使其易被损伤；同时线粒体是呼吸重要场所，处于高超氧化物的环境下更易受到损伤；并且缺乏有效DNA修复机制，修复能力非常有限[13]。线粒体DNA突变随着放射状母系而积累。当线粒体DNA获得功能性的突变有益于在特定环境中生存，于是这种线粒体DNA得到选择性的富集，并在这样的环境中形成了一组线粒体DNA单体型相关的群体，被称为单倍群[14]。它们组成了线粒体多态树的主要分支，并以发现的先后对照字母的顺序命名（A到Z）[15]。本研究的11个家系的先证者分别属亚洲线粒体单体型B5a、Z、N9、B4c1b、G2h、B5a、M7b、N9a10、C7b、M7b1和M10。

3 讨论

本研究对11个LHON家系的临床、遗传、分子特征进行了详细地研究。视神经病变为唯一的临床表型仅存在于携带相同质性MT-ND4 11778G＞A突变家系的母系成员中，说明线粒体基因突变是该病的分子基础。而此处令人惊讶的是11个家系中共有18人出现视神经性病变，而这18位患者皆为女性。这一现象与德国眼科医师Leber对LHON所作出的临床特征描述—偏倚青壮年男性[1-4]有所不符。而且，我们可以看到11 个家系中患者的发病年龄和发病时视力损伤程度及外显率都相差较大，虽然这些患者都有快速、无痛、双侧中枢视力丧失的共同的特点。家系内（数据未展示）和家系间的母系亲属表型变异范围广泛，包括严重程度、发病年龄和视力障碍外显率等，表明在LHON相关的m.11778G＞A突变表型表现中涉及到其他修饰因子（包括核修饰因子、线粒体单倍型、表观遗传和环境因素）的参与。早在之前的报道中就有提及LHON的男性优势、外显率较低、女性发病较迟等几个线粒体遗传而无法解释的特点[16]。因为男性高度偏倚使得X染色体连锁和线粒体基因被紧密联系在一起[16-18]。有学者曾提出假说:认为LHON这种疾病可能是X基因与线粒体DNA缺陷相互作用的结果[18]。HUDSON等[19]则定义了一个X染色体单倍体与特定的MTND突变相互作用，导致最常见的mtDNA疾病LHON的视力损伤。因此，我们也可以确定这11个家系中的母系女性患者的发病也涉及其他修饰因子的参与。

表4 蛋白编码区变异位点总结

在诸多修饰因子中，线粒体单倍体型也曾被提及与LHON有着一定的联系。线粒体单倍体型A、B、F、J1、J2、M、M7B1'2、M10a有增加LHON的风险，而线粒体单体型H和M8a则扮演着“保护因子”的角色[15，20]。其中，在意大利人群中单体型J（一种欧洲人特异单体型）有增加m.11778G＞A和m.14484T＞C突变的倾向。反过来，在单体型J上发生m.11778G＞A或（和）m.14484T＞C突变会增加LHON的外显率[21]。并且线粒体单体型J不同的亚型在LHON表达中发挥作用不同，单体型J2会增加m.11778G＞A突变携带者视力损伤的风险率，而单体型J1则会增加m.14484T＞C突变携带者的视力损伤的风险率。单体型H作为“保护因子”可以降低m.11778G＞A突变携带者的LHON外显率[20，22]。本研究11个家系先证者的单体型分别为B5a、Z、N9、B4c1b、G2h、B5a、M7b、N9a10、C7b、M7b1、M10，都属于亚洲人群的单体型。虽然，其他线粒体单体型（除J单体型）目前并没有报道与m.11778G＞A突变有较为强烈的偏向性，但也不排除其他线粒体单体型对携带m.11778G＞A突变的患者表型变异（包括严重程度、发病年龄和视力障碍外显率等）存在一定的影响。

当然，除了线粒体单体型外，11个家系中的患者表型差异也可能与其不良的生活习惯（抽烟、酗酒、吸毒等）、工作压力和精神状态（抑郁、孤僻等）等环境因素相关[23-24]；另外，也不排除患者的核基因修饰[19，25-26]或继发性位点突变也在LHON的生理病理过程中发挥了相应的作用。

综上所述，线粒体基因突变相关的LHON是一种多因素疾病，单纯的原发性位点（m.3640G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C）突变并不一定会引起视力损伤的临床症状（即LHON的不完全外显性），但原发性位点突变是视神经萎缩的一个危险因素[27]。伴随着核基因修饰、特异性线粒体单倍体型、不良生活环境或继发性突变位点的相互作用就有可能会增加LHON的外显率。