胎盘质膜脂肪酸结合蛋白与非妊娠糖尿病巨大儿发生的关联性

韩影，王晨晨，王玉环，叶艳，闫洪涛，杨新军

（1.温州医科大学 公共卫生与管理学院预防医学系，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 产科，浙江 温州 325027）

巨大儿是指出生体质量≥4 000 g的活产新生儿[1]。近年来，全球的巨大儿发生率均呈上升趋势[2-3]。巨大儿的发生不仅会增加肩难产等产科问题[4]，而且会增加其成年后患糖尿病、肥胖等代谢性疾病的风险[5-6]。目前国内外的研究多关注妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）巨大儿，而非GDM巨大儿发生的原因和机制仍不清楚[7]。已知长链多不饱和脂肪酸（long-chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA）对胎儿的发育具有重要作用，而且由于胎儿合成LCPUFA的能力有限，主要依靠胎盘从母体转运给胎儿[8-9]。胎盘过度转运脂肪酸会导致胎儿脂质水平异常，这可能是产生巨大儿或大于胎龄儿（large for gestational age，LGA）的原因之一[10]。本实验室前期研究发现脂肪酸转位酶在巨大儿胎盘中表达上调[11]，胎盘质膜脂肪酸结合蛋白（plasma membrane fatty acid-binding protein，FABPpm）与其他膜蛋白相比，对LCPUFA具有更高的亲和力，它能够优先摄取LCPUFA，且由于其只在胎盘母体面表达，更有利于LCPUFA从母体到胎儿的单向流动[12-13]。那么在非GDM巨大儿发生中，是否有胎盘FABPpm表达改变，影响胎盘脂肪酸过度转运尚不清楚。因此，本研究拟探讨胎盘FABPpm基因表达水平与巨大儿发生的关系，为非GDM巨大儿的发生机制提供新的线索。

1 资料和方法

1.1 一般资料 连续收集2015年6月至2016年6月在温州医科大学附属第二医院育英儿童医院产科进行常规产前检查并分娩的产妇及单胎足月新生儿作为研究对象。巨大儿组为出生体质量≥4 000 g的新生儿；对照组为随机选择的出生体质量2 500～3 999 g且与巨大儿分娩时间相差3 d以内的新生儿。入选标准:正常妊娠、单胎、足月分娩，糖耐量试验正常，新生儿无先天畸形。排除标准:有妊娠合并症者（如糖尿病、高血压、心脏病等）；有妊娠并发症（如胎盘异常、先兆子痫等）和新生儿先天畸形。本研究经温州医科大学附属第二医院育英儿童医院伦理委员会批准，所有产妇均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集:采用自行设计的调查表收集产妇和新生儿的基本信息，内容包括产妇年龄、身高、孕前体质量、孕前BMI、孕期体质量增加值、分娩方式、新生儿出生体质量及其他相关信息。

1.2.2 样品采集与处理:胎儿娩出后采用无菌注射器抽取脐静脉血10 mL，室温静置1 h，3 000 r/min离心20 min，将上层血清转移至5 mL冻存管中；胎盘娩出后，立即取胎盘母体侧滋养层组织1 cm3，放入经DEPC处理过的冻存管中，加入RNAlater（美国Ambion公司）保存。采集的样品液氮运输，并保存于-80 ℃冰箱待测。

1.2.3 胎盘RNA提取、反转录和qPCR检测:用TRIzol法提取胎盘总RNA，反转录后采取qPCR法测定胎盘FABPpm表达水平，选取GAPDH作为内参基因。所用引物序列如下:FABPpm上游:5'-GGAAGGAAATAGC AACAGTGG-3'，下游:5'-TCCTACACGCTCACCATATAAGC-3'，产物片段长度为191 bp；GAPDH上游:5'-CATGAGA AGTATGACAACAGCCT-3'，下游:5'-AGTCCTTCCACGATAC CAAAG-3'，产物片段长度为113 bp。qPCR反应条件为:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 个循环。PCR产物经熔解曲线与琼脂糖凝胶电泳分析，以保证产物的特异性。最后采用2-△△CT法进行数据处理。

1.2.4 Western blot法检测胎盘组织中FABPpm表达水平:取胎盘组织用PBS洗涤2次，弃上清，加入RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白质浓度，调整浓度一致，蛋白变性后-20 ℃保存。经SDS-PAGE后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，兔抗人抗体一抗（美国Abcam公司）1:2 000孵育过夜，TBST洗膜3次每次10 min，用山羊抗兔二抗（美国Abcam公司）1:5 000常温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，使用增强化学发光液显色，用凝胶成像系统采集图像，采用Quantity one凝胶图像分析系统对图像中蛋白条带的灰度值进行分析。

1.2.5 脐血游离脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）水平检测:采用铜试剂比色法检测，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3 统计学处理方法 问卷调查资料和实验数据统一录入EpiData 3.1数据库，运用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料如呈正态分布，则以形式表示，若非正态分布用M（P25，P75）表示。计量资料采用成组t检验或Mann-Whitney U检验；计数资料采用χ2检验或秩和检验。采用logistic回归分析巨大儿的影响因素，以OR（95%CI）来估计各因素对巨大儿发生的危险程度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 2组间新生儿性别、分娩方式、孕期体质量增加和新生儿出生体质量的差异有统计学意义（P＜0.05），其他因素如产妇年龄、孕前体质量、身高、孕前BMI、孕周、初产妇的比例在2组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 2组产妇及新生儿的基本特征比较（每组n=40）

图1 2组胎盘组织中FABPpm mRNA表达

2.2 胎盘FABPpm mRNA表达 qPCR检测结果显示，巨大儿组FABPpm mRNA表达量高于对照组，差异有统计学意义（Z=-2.519，P=0.012），见图1。进一步按照性别分层分析显示，在男性新生儿中，巨大儿组FABPpm mRNA表达量为1.33（1.02，1.78），高于对照组的1.03（0.91，1.23），差异有统计学意义（Z=-2.176，P＜0.001）；而在女性新生儿中，2组表达量差异无统计学意义[1.16（0.69，1.64） vs. 0.95（0.79，1.14），P＞0.05）]。

2.3 胎盘FABPpm蛋白表达水平 Western blot检测结果显示巨大儿组FABPpm的蛋白表达量高于对照组，差异有统计学意义（t=-3.769，P=0.002），见图2。

2.4 2组新生儿脐血NEFA浓度比较及与FABPpm的mRNA表达的相关性 2组新生儿脐血中NEFA的含量测定结果显示，巨大儿组为（274.72±138.08）μmol/L，低于对照组的（364.07±184.05）μmol/L（P=0.021）。相关性分析的结果显示，胎盘FABPpm表达量与脐血NEFA浓度在对照组中呈正相关关系（rs=0.334，P=0.046），但是在巨大儿组中，未观察到两者的直线相关关系（见图3）。

图2 2组胎盘FABPpm蛋白相对表达量

2.5 胎盘FABPpm mRNA表达与新生儿出生体质量的相关性 FABPpm mRNA表达量和新生儿出生体质量的相关性分析结果显示，2组中FABPpm mRNA均与出生体质量呈正相关，见图4。

2.6 巨大儿发生的影响因素分析 采用多因素logistic回归模型，对影响巨大儿发生的因素进行筛选与分析。以是否是巨大儿为因变量，其他因素如新生儿性别、孕期体质量增加、FABPpm mRNA表达量等为自变量进行logistic回归分析。各自变量赋值情况为:①胎儿性别:女=0，男=1。②孕期体质量增加:正常=0，不足=1，过多=2，孕期体质量增加的分类依据是美国医学研究所针对不同孕前BMI的孕妇推荐的孕期体质量增加适宜范围[14]:孕前BMI＜18.5 kg/cm2为12.5～18 kg；孕前BMI=18.5～24.9 kg/cm2为11.5～16 kg；孕前BMI=25.0～29.9 kg/cm2为7～11.5 kg；孕前BMI≥30 kg/cm2为5～9 kg。低于推荐范围为体质量增加不足，在推荐范围之内的为正常，超过推荐范围的为体质量增加过多。③FABPpm:低于中位数=0，高于中位数=1。④NEFA:低于中位数=0，高于中位数=1。在控制了新生儿性别、孕期体质量增加等因素之后，胎盘FABPpm mRNA的表达升高可增加巨大儿发生风险，且与胎儿性别、孕期体质量增加过多共同影响巨大儿的发生，见表2。

图3 2组胎盘FABPpm mRNA表达量与脐血NEFA浓度的相关性

图4 胎盘FABPpm基因mRNA表达水平与新生儿出生体质量的相关性分析

3 讨论

本研究发现在巨大儿胎盘中FABPpm mRNA和蛋白均呈现高表达。FABPpm表达量与脐血NEFA浓度在对照组呈正相关，而在巨大儿组未显示有意义的相关关系。多因素logistic回归分析控制相关混杂因素后，FABPpm高表达的OR仍然具有统计学意义，提示胎盘FABPpm表达上调可增加非GDM巨大儿发生风险，其可能是通过影响了胎盘脂肪酸转运进而影响巨大儿发生。

已知胎盘作为连接母体与胎儿的桥梁，负责将对胎儿发育必须的脂肪酸等营养物质输送到胎儿体内。胎盘FABPpm可通过加速摄取、转运和氧化LCPUFA来调节胎盘脂肪酸代谢过程[15-17]。那么巨大儿胎盘FABPpm基因mRNA和蛋白水平都呈高表达，可使巨大儿的胎盘具有相对更高的能力摄取并转运母体脂肪酸给胎儿。当大量脂肪酸在胎儿体内以脂肪形式沉积，便容易获得更多的身体脂肪和更大的体质量。另外，我们发现在男性新生儿中，巨大儿胎盘中FABPpm表达量高于对照组，而女性新生儿中，2组并无差异，这可能是由于男性新生儿比女性新生儿对脂肪酸有更高的需求[18]，使得男性巨大儿胎盘代偿性地表达更多的FABPpm，才能摄取更多的脂肪酸以满足胎儿的需求。这也可能部分地解释了巨大儿男婴多于女婴的现象。

本研究发现NEFA在巨大儿脐血中含量降低，且对照组胎盘FABPpm表达与脐血NEFA浓度呈正相关关系，但在巨大儿组两者并未发现有意义的相关性。该结果提示我们，除了胎盘的脂肪酸转运之外，可能还有其他的因素影响胎儿脐血NEFA的含量。如有研究报道在巨大儿脐血中含有更高的胰岛素[19]，而胰岛素的高表达能够促进脂肪酸的再酯化，使得巨大儿脐血中NEFA含量降低。另一个可能的影响因素是，巨大儿对脂肪酸的需求比正常胎儿更高，大量脂肪酸被巨大儿用于合成自身脂肪并沉积。由于这些影响因素的存在，所以即使上调的FABPpm摄取并转运更多的脂肪酸给巨大儿，但是其脐血中NEFA含量却不高，且在巨大儿组中并未观察到FABPpm与NEFA的直线相关关系。另外，本研究还发现，胎盘FABPpm表达量与出生体质量在2组中均呈正相关关系。这说明了胎盘FABPpm的表达会增加胎盘对脂肪酸的摄取和转运[15-17]，使胎儿获得更多的用于脂肪合成的原料，造成体内更多的脂肪沉积，因此出生体质量会增加。

本研究分析获得的其他影响巨大儿发生的相关因素与以往的研究结果相一致[20]，男性胎儿和孕期体质量增加过多都会增加巨大儿的发生风险。在控制了混杂因素之后，胎盘FABPpm mRNA高表达仍然会增加巨大儿发生风险，提示FABPpm作为重要调节因子可能通过影响巨大儿脂肪酸转运而参与巨大儿的形成。

表2 巨大儿发生的影响因素

本研究也存在不足之处。首先，该研究是一项病例对照研究，不能评估各因素与巨大儿发生的因果关系。其次，由于研究的样本量有限，多因素分析模型中危险度估计的可信区间较宽，可能会影响估计的精确性。因此，进一步的研究需要增加样本量，并通过细胞模型和实验动物模型探讨脂肪酸在胎盘中转运的具体机制，从而帮助我们深入了解胎盘脂肪酸转运代谢相关蛋白在巨大儿发生中的作用。

综上所述，胎盘FABPpm mRNA和蛋白表达上调，会增加巨大儿发生风险。提示可能是由于FABPpm参与了胎盘脂肪酸的转运从而调节新生儿出生体质量，进而影响巨大儿发生。该结果为探索非GDM巨大儿发生机制提供了新的线索。