miR-135b-5p靶向KLF4基因调控胃癌SGC-7901细胞生物学行为的研究

刘小娟， 孙 科

成都市第二人民医院 1.消化科； 2.肝胆外科，四川 成都 610000

胃癌是全球范围内常见的消化系统恶性肿瘤，在全球癌症相关死亡原因中高居第二位[1]。尽管手术和化疗等方式在胃癌的治疗中取得了较大的进展，但发生淋巴结转移的晚期胃癌患者的预后仍然很差[2]。然而，胃癌的发病机制目前尚未完全清楚，因此，进一步探索胃癌发病及发展的分子机制，寻找及鉴定新的治疗靶标或预后标志物，对胃癌的治疗及预后具有重要意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种内源性、非编码小RNA，长度为20～25个核苷酸，能够通过抑制翻译或/和切割靶向mRNA来调节转录后的靶基因表达水平[3-4]。在胃癌中，对miRNA及其功能的研究为其治疗策略提供了新的靶点[5-6]。使用生物信息学重叠亚类分析从癌症基因组图谱数据库中找到肿瘤等级和淋巴转移相关的胃癌特异性miRNA，其中miR-135b-5p在胃癌组织中表达异常升高[7]。目前研究显示，miR-135b-5p与胃癌的发生、发展存在相关性[8-9]。然而，miR-135b-5p在胃癌进展中的作用及其调节肿瘤细胞增殖和转移的潜在机制尚不清楚。KLF4(Krüppel-like factor 4)基因是一种广泛存在于多种组织中的锌指转录因子，在胃癌的发病及进展中发挥重要作用[10]。本实验前期经生物信息学软件预测发现，miR-135b-5p与KLF4存在靶向结合位点，因此推测，miR-135b-5p可能通过靶向KLF4调控胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为。因此本实验旨在探讨miR-135b-5p是否靶向KLF4影响胃癌细胞生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材料人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1及胃癌SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS细胞株均购自美国ATCC公司；RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司；青霉素-链霉素、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、胰蛋白酶购自碧云天生物技术研究所；胎牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；miR-135b-5p inhibitor、miR-135b-5p mimic及对照购自上海吉玛制药技术有限公司；Trizol提取试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司；逆转录试剂盒及RT-PCR检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；Transwell小室购自美国Millipore公司；MTT试剂购自美国Sigma公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Annexin V-FITC双染色凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；KLF4抗体及二抗购自美国Abcam公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 细胞培养人正常胃黏膜上皮细胞GES-1及胃癌SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS细胞培养在质量浓度为100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养基中加入100 U/ml青霉素和100 g/L链霉素，置体积分数为5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。根据细胞生长状态更换新鲜培养基及传代培养。取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染和分组转染前1 d，将生长状态良好的胃癌SGC-7901细胞以3×103个/孔接种于6孔板中，于37 ℃恒温箱中继续培养，待细胞密度为50%～60%时进行转染实验，将转染miR-135b-5p inhibitor的SGC-7901细胞记为miR-135b-5p inhibitor组，将转染对照的SGC-7901细胞记为NC组，不做转染处理的SGC-7901细胞记为Control组。转染操作步骤按照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂说明书进行，转染6 h后更换质量浓度为100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，在体积分数为5% CO2、37 ℃条件下继续培养48 h。

1.4 RT-PCR检测处于对数生长期的人胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS细胞采用Trizol法提取细胞中总RNA，此外，上述转染48 h后的各组SGC-7901细胞同样以Trizol法提取细胞中总RNA。采用核酸蛋白超微量检测仪测定RNA的纯度和浓度，参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR扩增，计算细胞中miR-135b-5p和KLF4相对表达水平。miR-135b-5p和KLF4相对表达水平分别以GAPDH、U6为内参。采用2-△△CT法计算细胞中miR-135b-5p和KLF4相对表达水平。所用引物：U6-F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。GAPDH-F：5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′，GAPDH-R：5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。miR-135b-5p-F：5′-GGTATGGCTTTTCATTCCT-3′，miR-135b-5p-R：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。KLF4-F：5′-ATGGGCAAGTTCGTGCTGAAGGC-3′，KLF4-R：5′-GCATCTGATCGGGCAGGAAGGAT-3′。

1.5 Western blotting检测分别收集转染48 h的各组胃癌SGC-7901细胞，加入细胞裂解液，置冰上提取各组细胞中总蛋白，采用BCA法对蛋白浓度进行检测，取40 μg蛋白样品加入到10% SDS-PAGE上样孔中，110 V恒压进行电泳，待蛋白分离后，采用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，在质量浓度为50 g/L牛血清白蛋白中封闭1 h，加入KLF4一抗(1∶800稀释)4 ℃过夜杂交，TBST洗膜3次后再加入二抗(1∶3 000稀释)室温孵育2 h。TBST洗膜后，加入ECL化学发光液，显色，以凝胶成像系统读取图像，以GAPDH为内参，采用Image J图像分析软件分析细胞中KLF4蛋白表达水平。

1.6 MTT法检测细胞增殖能力转染48 h后的各组SGC-7901细胞分别以MTT法检测细胞增殖能力，即在每孔细胞中加入MTT溶液50 μl，在37 ℃恒温箱中继续孵育4 h，再向每孔细胞中加入二甲基亚砜200 μl，振荡反应10 min，在酶标仪上检测每组细胞光密度值(OD值)，检测波长为490 nm。实验重复3次，以OD值反映各组SGC-7901细胞增殖能力。

1.7 Annexin V/PI检测细胞凋亡率收集转染后48 h的各组SGC-7901细胞，以质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞，以Binding buffer结合缓冲液重悬细胞，制成1×106ml-1的单细胞悬液，取100 μl细胞悬液，分别向细胞悬液中加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，轻轻混匀，室温避光静置15 min，采用流式细胞仪检测，实验重复3次，统计各组SGC-7901细胞凋亡率。

1.8 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力将各转染组细胞接种于24孔板中，接种密度为4×104/孔，常规培养24 h，将以Matrigel基质胶铺底的Transwell小室放入细胞培养板中，Transwell小室的上室加入2×104细胞，Transwell小室的下室加入质量浓度为100 g/L胎牛血清的培养基，于37 ℃恒温培养箱中继续培养48 h。取出Transwell小室，用PBS洗涤3次，以甲醇染色15 min，结晶紫染色15 min，用棉签拭去上室细胞，在显微镜下观察并计算侵袭至膜下层的细胞数，实验重复3次，以平均穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。以同样的方法检测细胞迁移能力，不同之处在于Transwell小室不以Matrigel涂层，其余均同侵袭实验。

1.9 双荧光素酶报告基因实验使用生物信息学软件TargetScan预测miR-135b-5p靶基因结合位点，预测结果显示，KLF4 3′-UTR与miR-135b-5p能够靶向结合，说明KLF4可能是miR-135b-5p的靶基因。分别扩增与miR-135b-5p结合的KLF4 3′-UTR序列及突变序列，分别构建野生型载体KLF4 3′UTR-Wt及突变型载体KLF4 3′UTR-Mut，将构建好的载体分别与miR-135b-5p mimic及对照共转染至SGC-7901细胞中，以双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶活性及海肾荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性。

1.10 统计学分析采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计学分析，采用单因素方差分析多组间差异，采用SNK-q检验分析组间差异，每组数据代表3个生物学重复，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-135b-5p在不同细胞中的表达情况通过RT-PCR检测了人胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS中miR-135b-5p表达水平，结果如表1所示，与GES-1细胞相比，胃癌SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS细胞中miR-135b-5p的表达水平均显著上调(P<0.05)。胃癌SGC-7901细胞中miR-135b-5p的表达水平高于胃癌MKN-45、BGC-823、AGS细胞(P<0.05)，后续选取SGC-7901细胞作为转染miR-135b-5p inhibitor的细胞株。

2.2 在SGC-7901细胞中转染miR-135b-5p inhibitor对miR-135b-5p和KLF4表达的影响分别将miR-135b-5p inhibitor及对照转染至胃癌SGC-7901细胞中，48 h后检测miR-135b-5p的表达水平，miR-135b-5p inhibitor组SGC-7901细胞中miR-135b-5p表达水平显著低于Control组和NC组(P<0.05)，提示转染miR-135b-5p inhibitor能够下调SGC-7901细胞中miR-135b-5p的表达。RT-PCR和Western blotting检测结果显示，miR-135b-5p inhibitor组细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达水平明显高于Control组和NC组(P<0.05)(见表2、图1)。提示下调miR-135b-5p的表达能够促进KLF4基因的表达。

表1 RT-PCR检测胃黏膜上皮细胞及各胃癌细胞中miR-135b-5p的表达水平Tab 1 miR-135b-5p expressions in gastric mucosal epithelial cells and gastric cancer cells detected by RT-PCR

注：与GES-1细胞相比，*P<0.05；与SGC-7901细胞相比，&P<0.05。

表2 RT-PCR和Western blotting检测细胞中miR-135b-5p和KLF4的表达水平Tab 2 The expressions of miR-135b-5p and KLF4 in cells detected by RT-PCR and Western blotting

注：与Control组相比，*P<0.05；与NC组相比，&P<0.05。

图1 Western blotting检测各组SGC-7901细胞中KLF4蛋白表达水平Fig 1 Expression of KLF4 protein in each groupof SGC-7901 cells detected by Western blotting

2.3 下调miR-135b-5p后对SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响MTT实验检测结果显示，miR-135b-5p inhibitor组细胞OD值明显低于Control组和NC组(P<0.05)，说明下调miR-135b-5p明显抑制了胃癌SGC-7901细胞增殖能力。流式细胞术检测结果显示，miR-135b-5p inhibitor组细胞凋亡率明显高于Control组和NC组(P<0.05)(见图2、表3)。说明下调miR-135b-5p能够诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡。

图2 流式细胞术检测各组SGC-7901细胞凋亡率Fig 2 The apoptotic rate of SGC-7901 cells of each group detected by flow cytometry

表3 下调miR-135b-5p对SGC-7901细胞OD值及凋亡率的影响Tab 3 Effect of down-regulation of miR-135b-5p on OD value and apoptosis rate of SGC-7901 cells

注：与Control组相比，*P<0.05；与NC组相比，&P<0.05。

2.4 下调miR-135b-5p后对SGC-7901细胞侵袭和迁移能力的影响通过Transwell实验检测SGC-7901细胞侵袭和迁移能力，miR-135b-5p inhibitor组侵袭和迁移细胞数明显少于Control组和NC组(P<0.05)，说明下调miR-135b-5p能够明显抑制胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移(见表4)。

2.5 KLF4是miR-135b-5p的靶基因TargetScan在线数据库预测结果显示，miR-135b-5p能够靶向结合KLF4 mRNA 3′UTR(见图3A)。将miR-135b-5p mimic、对照分别与野生型载体KLF4 3′UTR-Wt及突变型载体KLF4 3′UTR-Mut共同转入SGC-7901细胞，结果显示，miR-135b-5p mimic与KLF4 3′UTR-Wt共转染组相对荧光强度显著低于miR-135b-5p对照组(P<0.05)；突变型载体KLF4 3′UTR-Mut转染组间相对荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)(见图3B)。以上实验结果说明KLF4是miR-135b-5p直接靶基因。

表4 下调miR-135b-5p对SGC-7901细胞侵袭和迁移细胞数的影响Tab 4 Effect of down-regulation of miR-135b-5p on the number of invasion and migration of SGC-7901 cells

注：与Control组相比，*P<0.05；与NC组相比，&P<0.05。

注：与miR-135b-5p NC组相比，*P<0.05。

图3 miR-135b-5p靶向KLF4验证A：miR-135b-5p靶向结合KLF4 mRNA 3′UTR示意图；B：双荧光素酶报告基因实验

Fig 3 miR-135b-5p targeted KLF4 validationA: miR-135b-5p targeted binding to KLF4 mRNA 3′UTR schematic;B: dual luciferase reporter gene assay

3 讨论

目前普遍认为miRNA是复杂生物过程的调节因素，已引起很多研究学者的兴趣。目前研究证实，miRNA可在人类恶性肿瘤中通过靶向下游基因发挥肿瘤抑制或致癌作用，参与肿瘤的进展和转移[11]。miR-135b位于1号染色体上，miR-135b有miR-135b-5p和miR-135b-3p两种剪切体。目前研究表明，miR-135b在乳腺癌[12]、前列腺癌[13]、肝癌[14]等多种肿瘤中呈高表达，且与肿瘤临床分期、淋巴结转移及分化程度呈显著相关性。HUA等[15]研究指出，miR-135b在乳腺癌中表达上调，通过调节LATS2促进细胞生长。有研究表明，lncRNA GAS5通过抑制miR-135b在非小细胞肺癌中的表达抑制肿瘤发生并增强放射敏感性[16]。在骨肉瘤研究中，miR-135b通过靶向FOXO1促进骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[17]。后续研究发现，miR-135b-5p过表达通过抑制胰腺癌中SFRP4的表达，促进临床特征不良和预后不良[18]。以上研究提示，miR-135b-5p在肿瘤中发挥促癌作用。在胃癌研究中，多项研究表明，miR-135b-5p在胃癌组织中呈高表达，能够促进胃癌生长[19-20]，但其作用机制目前尚不十分清楚。本实验结果发现，与正常胃黏膜上皮细胞相比，miR-135b-5p在胃癌细胞中表达水平显著升高。这与先前有关miR-135b-5p在胃癌组织和细胞系中表达上调的研究一致。此外，本实验在胃癌SGC-7901细胞中转染miR-135b-5p inhibitor，经检测发现，下调miR-135b-5p的表达后SGC-7901细胞增殖能力减弱，凋亡率升高，侵袭和迁移能力均受到明显抑制。以上这些实验结果表明miR-135b-5p在胃癌进展中起关键作用。

为探讨miR-135b-5p在胃癌中作用的潜在机制，本实验探究了KLF4是否为miR-135b-5p的直接靶标。KLF4是KLF家族锌指转录因子的成员，与细胞增殖、生长停滞和晚期细胞分化有关[21-23]。在胃癌中，KLF4的功能已被定性为肿瘤抑制因子，并且可作为患者生存的预后预测因子[24]。KLF4的过度表达显著抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和转移[25]。本研究首先通过靶基因预测筛选出KLF4为miR-135b-5p的潜在靶基因。下调miR-135b-5p的表达后发现KLF4 mRNA和蛋白表达水平均上调，提示miR-135b-5p可能调控KLF4的表达，抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移，诱导SGC-7901细胞凋亡。最后双荧光素酶报告基因实验证实了KLF4是miR-135b-5p的直接靶标。这些结果表明，miR-135b-5p的下调可通过靶向KLF4抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡。

总之，本研究显示miR-135b-5p在胃癌细胞中过表达与胃癌的发生和进展有关。miR-135b-5p可促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡。为了研究直接靶向机制，KLF4被鉴定为miR-135b-5p的直接靶标。miR-135b-5p通过抑制胃癌中的靶基因KLF4而作为致癌基因发挥作用。