广东清远IVS—Ⅱ—654点突变β地中海贫血的分子流行特征及血液表型分析

林金端 刘红伟 望丹丹

[摘要] 目的 了解廣东省清远地区IVS-Ⅱ-654点突变β地中海贫血（以下简称“654Mβ地贫”）基因携带情况及基因型组合特点，并分析其红细胞参数特点，为更好地筛查和预防地贫提供参考数据。 方法 收集2014年1月～2015年9月清远市人民医院门诊地贫基因诊断标本6760例，根据受检者年龄将标本分为婴幼儿组（≤3岁，n = 804），儿童组（>3岁～<18岁，n = 1050），成人（≥18岁n = 4856）。采用gap-PCR扩增法检测3种常见的缺失型α地贫基因（-α3.7/、-α4.2/、--SEA/），PCR-膜反向点杂交（PCR-RDB）技术检测17种突变型β地贫基因，统计654Mβ基因的携带率；并对基因型为654M的受检者进行血常规检测，观察红细胞计数（RBC）、血红蛋白浓度（Hb）、红细胞压积（Hct）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）6项指标，分析性别、年龄等因素对654Mβ基因的携带者红细胞参数的影响，并与（第4版）《全国临床检验操作规程》比较，观察654M杂合子与健康人红细胞参数的异同。 结果 ①调查人群中，654M总携带率为4.79%（324/6760），其中654M杂合子256例（3.79%），654M复合α地贫52例（0.77%），654M复合β地贫 16例（0.24%）；各年龄组654M杂合子携带率和654M复合α地贫基因携带率比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）；婴幼儿组654M复合β地贫基因携带率高于儿童组，差异有统计学意义（P < 0.05），成人组目前未发现654M复合其他β地贫基因的基因型。②654M杂合子、654M复合α地贫基因和654M复合β地贫基因三种基因型对RBC、Hb、Hct影响大小顺序为654M复合β地贫>654M杂合子>654M复合α地贫（均P < 0.05），但三种基因组合的MCV、MCH、MCHC差异均无统计学意义（P > 0.05）。③不同人群的654M杂合子携带者的红细胞参数差异表现在男性RBC、Hb、Hct高于成人女性、男性婴幼儿与男性儿童，差异均有统计学意义（P < 0.05），其他组间各红细胞参数差异均无统计学意义（P > 0.05）。④与健康人比较，男性654M杂合子的血液表型主要体现在RBC增高，MCV、MCH、MCHC下降（均P < 0.05）；Hb、Hct处于临界低值（均P > 0.05）；女性654M杂合子血液表型主要体现Hb、Hct、MCV、MCH、MCHC下降（均P < 0.05）；RBC处于临界高值（P > 0.05）。 结论 清远地区654Mβ地贫以654M杂合子最为常见，其次为654M复合α地贫，654M复合β地贫最为少见。不同基因组合的654Mβ地贫红细胞参数差异较大，在进行遗传咨询时，应做好遗传告知；成年男性654M RBC、Hb、Hct与婴幼儿、儿童及成人女性的差异较大，在制订筛查指标临界值时需注意区分。

[关键词] IVS-Ⅱ-654点突变；地中海贫血；基因型；红细胞参数

[中图分类号] R556 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）05（a）-0078-05

Molecular epidemiology and blood phenotype analysis of IVS-Ⅱ-654 point mutation β-thalassemia in Qingyuan，Guangdong Province

LIN Jinduan1 LIU Hongwei2 WANG Dandan3 YIN Weiguo1 LIU Qian1 LIU Yanmei1 HUANG Zhengyong1 LI Jiehua1

1.Department of Clinical Laboratory， the Sixth Affiliated Hospital to Guangzhou Medical University Qingyuan People′s Hospital， Guangdong Province， Qingyuan 511500， China； 2.Department of Blood Transfusion Room， the Sixth Affiliated Hospital to Guangzhou Medical University Qingyuan People′s Hospital， Guangdong Province， Qingyuan 511500， China； 3.Department of Gynaecology and Obstetrics， the Sixth Affiliated Hospital to Guangzhou Medical University Qingyuan People′s Hospital， Guangdong Province， Qingyuan 511500， China

[Abstract] Objective To investigate Guangdong Qingyuan District IVS-Ⅱ-654 point mutations beta thalassaemia （hereinafter referred to as the "654 M beta lean"） gene and genotype combination characteristic， and analysis the features of red blood cell parameters， provide a reference for better screening and prevention to poor data. Methods From January 2014 to September 2015， 6760 samples of geologically deficient gene diagnosis in the Outpatient Department of Qingyuan People′s Hospital were collected. According to the age of the subjects， the samples were divided into infant group （3 years old）， child group （> 3 years old-18 years old）， and adult group （≥18 years old）. Gap-PCR amplification was used to detect 3 common deletion geoimpoverished genes （-α3.7/、-α4.2/、--SEA/）. PCR- membrane reverse point hybridization （PCR-RDB） was used to detect 17 mutated geoimpoverished genes. And the genotypes of 654 M β. Routine blood test was used to observe the red blood cell count （RBC）， hemoglobin （Hb） concentration， red blood cells deposited （Hct）， mean red cell volume （MCV）， mean red blood cell hemoglobin content （MCH） and red blood hemoglobin concentration （MCHC） 6 indicators， the influence of factors such as gender， age of 654 Mβ gene carriers on the red blood cell parameters was analyzed， with the fourth edition of the national clinical laboratory operation rules， 654 M heterozygote and healthy red blood cell parameters of the similarities and differences were observed. Results ①Among the investigated population， the total carrier rate of 654M was 4.79% （324/6760）， including 256 cases of 654M heterozygote （3.79%）， 52 cases of 654M complex ground poverty （0.77%）， and 16 cases of 654M complex ground poverty （0.24%）. There was no statistically significant difference in the 654M heterozygote and 654M complex α （P > 0.05）. Infants and toddlers group 654 M compound β to lean gene carrying rate was higher than children series， the difference was statistically significant （P < 0.05）， in not currently found 654 M compound other β to lean gene genotypes， 654 M heterozygote. ②654 M compound α to lean gene and 654 M composite β to a poverty of three genotypes of RBC， Hb， Hct influence size order for 654 M compound β to lean heterozygous > 654 M>654 M compound alpha to lean （all P < 0.05）， but the three gene combinations of MCV， MCH， MCHC differences had no statistical significance （P > 0.05）. ③The red blood cell parameters of 654M heterozygous carriers in different groups were higher in male RBC， Hb， Hct than in adult female， male infants and male children， and the differences were statistically significant （P < 0.05）， while the differences in red blood cell parameters between other groups were not statistically significant （P > 0.05）. ④Compared with healthy people， male 654M heterozygous blood phenotype was mainly reflected in RBC increased， MCV， MCH， MCHC decreased （all P < 0.05）； Hb and Hct were in the critical low value （all P > 0.05）. The Hb， Hct， MCV， MCH and MCHC of female heterozygote 654M were decreased （all P < 0.05）. RBC′s were at a critical high （P > 0.05）. Conclusion In qingyuan area 654M， the parameters of 654M deficient erythrocytes in different gene combinations are quite different. Adult male 654M RBC， Hb， Hct are significantly different from infants， children and adult females， so it is necessary to pay attention to the distinction when setting the critical value of screening indicators.

[Key words] IVS-Ⅱ-654 point mutation； Thalassemia； Genotype； Erythrocyte parameters

β地中海贫血（简称“β地贫”）是由于β-珠蛋白基因发生突变，导致β珠蛋白链合成减少或合成障碍，引发α珠蛋白和β珠蛋白链比例失衡、红细胞脆性增加的一种溶血性贫血，已成为我国广西、广东等地危害最大的单基因遗传病。据报道，IVS-Ⅱ-654点突变β地贫（简称“654Mβ地贫”）是我国最常见的β地贫基因型之一，其发生率在福建龙岩、厦门和广东潮州、深圳等地区位居第一[1-4]。大规模的人群筛查，对可疑的对象进行基因确诊，对高危的夫妇进行遗传咨询并进行产前干预是预防和控制地贫的有效手段。目前临床常用血液表型对地贫进行筛查，根据血液表型决定是否需要进行进一步的检查确证[5-6]。β地贫发病机制复杂，不同基因型的血液表型特征各异。目前，国内尚无有关于654M基因型比较系统的血液学表型的研究资料。本研究通过检测清远地区6760例标本，统计654M地贫的携带率和基因型并分析其血液表型，为更好地筛查和预防地贫提供参考资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料

标本来源于2014年1月～2015年9月清远市人民医院门诊送检进行地贫基因诊断检查的外周全血，排除缺铁性贫血、感染、急性失血、以及近期服用影响血细胞参数药物（如促红细胞生成素、升白胺）等影响，所有患者受检时未输过血或受检时距末次输血时间超过1个月，符合条件共6760人。根据受检者年龄将标本分为婴幼儿组（≤3岁，n = 804），儿童组（>3岁～ <18岁，n = 1050），成人组（≥18岁，n = 4856）。

1.2 仪器与试剂

血细胞分析仪（BC5380）及原装配套试剂、BIO-RAD CFX96PCR扩增仪，地贫基因检测试剂盒为深圳益生堂公司产品。

1.3 检测方法

1.3.1 血细胞分析 静脉抽取2 mL EDTA抗凝血，BC5380血细胞分析仪上进行红细胞计数（RBC）、血红蛋白浓度（Hb）、红细胞压积（Hct）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）6项指标检测。

1.3.2 地贫基因分析 枸盐酸抗凝管抽取3 mL静脉血，采用全血基因组提取试剂盒提取全血DNA组，进行单管多重PCR扩增，采用PCR-膜反向点杂交（PCR-RDB）技术检测中国人群基因组DNA中β珠蛋白基因突变的8个常见位点和9个少见位点；采用跨断裂位点PCR（gap-PCR）法检测中国人常见的三种缺失型α地贫基因（-α3.7/、-α4.2/、--SEA/）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，有差异者再进行LSD两两比较；计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 結果

2.1 654Mβ地贫基因携带情况及基因型分布

6760例标本中，检出654M基因型324例，人群总携带率为4.79%，其中654M杂合子256例（3.79%），654M复合α地贫52例（0.77%），654M复合β地贫 16例（0.24%）；各基因组合的分布特点为：654M杂合子>654M复合α地贫>654M复合β地贫。各年龄组间654M杂合子携带率、654M复合α地贫基因携带率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；654M复合其他β地贫基因婴幼儿组携带率高于儿童组（P < 0.05），其中，三种缺失型α地贫复合654Mβ地贫的基因组合在各个年龄段均可见，而654M复合β地贫以婴幼儿多见，儿童中组中654M复合β地贫仅见于3岁以下小童，且多需要输血。成人组内目前未发现654M复合其他β地贫基因的基因组合。见表1。

2.2 654M杂合子、654M复合α地贫、654M复合β地贫的血液学表型比较

654M杂合子、654M复合α地贫表现为小细胞低色素性轻度贫血或不贫血；654M复合β地贫表现为小细胞低色素性中度到重度贫血。对红细胞参数的影响大小为654M复合β地贫>654M杂合子>654M复合α地贫；方差分析结果显示，654M杂合子、654M复合α地贫和654M复合β地贫三组的RBC、Hb、Hct差异均有统计学意义（均P < 0.05），而MCV、MCH、和MCHC差异均无统计学意义（均P > 0.05）。进一步进行LSD两两比较，654M复合β地贫与654M杂合子、654M复合α地贫的RBC、Hb、Hct 的差异均有统计学意义（均P < 0.05），而654M杂合子与654M复合α地贫基因型的RBC、Hb、Hct差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表2。

2.3 654M杂合子的血液型表型特点分析

2.3.1 性别对654M杂合子红细胞参数的影响 成人男性的RBC、Hb、Hct高于成年女性；成人男性与女性间MCV、MCH、MCHC差异均无统计学意义（均P > 0.05）；男性婴幼儿与女性婴幼儿、男性儿童与女性儿童间的各红细胞参数差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表3。

2.3.2 年龄对654M杂合子红细胞参数的影响 婴幼儿组、儿童组、成人组间女性患者各参数差异均无统计学意义（均P > 0.05）；三组间男性患者RBC、Hb、Hct差异均有统计学意义（均P < 0.05），进一步进行LSD两两比较发现，男性患者中，成人组RBC、Hb、Hct高于婴幼儿组和儿童组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；男性婴幼儿组和儿童组间MCV、MCH、MCHC，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表3。

2.3.3 各组人群654M杂合子红细胞参数与健康人群比较 与《全国临床检验操作规程》（第4版）[7]红细胞参数比较，男性654M杂合子的血液表型主要体现在RBC增高，MCV、MCH、MCHC下降，差异均有统计学意义（均P < 0.05），Hb、Hct处于临界低值，差异均无统计学意义（均P > 0.05）；女性654M杂合子的血液表型主要体现在RBC处于临界高值，差异均无统计学意义（均P > 0.05），Hb、Hct、MCV、MCH、MCHC下降，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；婴幼儿、儿童Hb值低于《全国临床检验操作规程》（第4版）的临界低值，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。由于（第4版）（全国临床检验操作规程）（第4版）未列出婴幼儿、儿童RBC、MCV、MCH、MCHC参考值范围，故未做比较。

3 讨论

地贫是可防可控难治[8]的遗传性疾病，重型地贫患者需要长期输血以及去铁治疗，对家庭和社会造成严重的负担。增强对高发地区婚前，产前以及围生期的地贫血液表型筛查和基因诊断并及时作出干预是预防地贫患儿出生，提高人口质量的有效措施[9]。血液表型筛查是以红细胞形态及理化特性为其诊断依据，是大范围人群筛查地贫基因携带者的主要手段[10]，不同基因型别地贫患者的血液理化特性差异较大[11-13]，研究常见基因型别的地贫人群的血液参数特点，对地贫的防控具有重要作用。本研究结果显示清远地区的654M基因型携带率为4.79%，处于比较高的携带水平，高于广东省的平均携带水平（3.8%）[14]，也高于福建龙岩等地的携带率（3.6%）[1]，因此研究654Mβ地贫的血液表型具有重要作用。654M β地贫是指在β珠蛋白基因的IVS-Ⅱ-654位点发生C-T突变，由于RNA加工突变产生异常剪切产物，从而使β珠蛋白链合成减少，α/β珠蛋白比例失衡，多余的α珠蛋白沉积在红细胞膜上，导致红细胞脆性改变发生的溶血性贫血。本研究中，654M杂合子的血液表型改变主要体现在MCV、MCH的改变，贫血多不明显，甚至是不发生贫血，可能是由于654M β地贫属于β+地贫，与β0地贫的血液型改变有所差异。654M杂合子的血液表型改变程度女性不同于男性，与《全国临床检验操作规程》（第4版）参考值比较，男性654M杂合子主要体现RBC的增高，而Hb、Hct下降幅度较小，处于正常成年男性参考值低值；而女性654M杂合子则表现为Hb、Hct下降，RBC上升的幅度较小，处于正常成人女性的参考值高值水平，这可能与体内代偿机制有关。由于珠蛋白基因的缺陷，血红蛋白合成减少，机体通过一系列机制调控，力求纠正该不足，因此，654M基因携带者的RBC可高于正常人（男性）或者是处于正常高值（女性）。而RBC增高的幅度，男性要明显高于女性，这可能与体内雄激素水平有关，雄激素水平可促进体内EPO的表达[15]，与RBC、Hb水平有关[16]，而幼儿、儿童第二性征尚未发育，因此幼儿、儿童组内，RBC、Hb、Hct参数不存在性别差异。

通过比较654M杂合子、654M复合α地贫、654M复合β地贫三种基因型的红细胞参数发现，不同基因组合的654M地贫患者紅细胞的MCV、MCH差异不大。但是，654M复合β地贫患者的RBC、Hb、Hct明显低于654M杂合子和654M复合α地贫患者。正常人每条染色体上分别含有一个珠蛋白基因，β珠蛋白基因上不同位点的突变会导致β珠蛋白肽链合成链的不同，654M虽然为β+地贫，贫血症状不明显，但是若复合其他类型的β突变，将进一步导致β珠蛋白肽链的减少而加重贫血症状；而654M复合α地贫基因，在β珠蛋白合成减少的基础上，α珠蛋白也合成减少，这在一定程度上纠正了α/β珠蛋白比例失衡，减少溶血的发生，因此贫血症状多不明显。

在针对人群654M复合β地贫携带率研究中发现，654M复合β地贫基因携带率明显低于654M杂合子、654M复合α地贫，贫血症状较明显，以<3岁的婴幼儿多见，这可能与β珠蛋白的基因功能有关，合成β珠蛋白的基因位于人体11号染色体短臂11p15.5的β珠蛋白基因簇，由于β基因主要在出生后才有很高的表达水平，当发生IVS-Ⅱ-654位点突变合并其他β地贫突变时，由于在胎儿发育直至出生时，该基因基本处于关闭状态，所以654M合并其他β地贫基因这种双重β基因突变对基因的抑制作用难以显示，患儿在出生时并不会表现出疾病表型。只有在出生后随着年龄的增长，β基因开放，由于突变使β基因明显受到抑制而不能表达或很低水平的表达出β珠蛋白链，患儿才表现出贫血的临床症状。一般情况下，一种β地贫基因复合另一种β地贫基因的患儿会在出生后几个月发病，并随着生长发育逐渐加重，若不加以治疗，很难存活到成年[17-19]，因此，654M合并其他类型β地贫基因突变的基因组合以<3岁的婴幼儿多见。但是本研究由于仅检测到16例654M复合其他β地贫，例数较少，未进一步对其具体基因型的红细胞参数特点进行研究比对，654M复合不同突变点的β基因突变双重杂合子的血液表型特点有待进一步研究。

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（收稿日期：2018-07-20 本文编辑：封 华）