天山堇菜秦皮乙素大孔树脂分离纯化工艺优化

赵丽娟 - 李 倩 李晨阳 - 徐 芳 赵 军

(1. 新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2. 新疆药物研究所维吾尔药重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830004)

天山堇菜是堇菜科堇菜属多年生草本植物，以全草入药，主要分布于海拔3 000 m以上的天山山区[1-2]。该药材可水煎或泡茶使用，气味微苦，具有清热祛风、解毒消肿的疗效，主要用于发烧、头痛、咽痛、小儿惊厥等疾病的治疗。现代药理学研究[3]表明天山堇菜具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等多种生物活性，其化学成分包含香豆素、黄酮、生物碱、皂苷和挥发油等，其中秦皮乙素是其主要的标识性成分。秦皮乙素又名七叶内酯、6,7-二羟基香豆素，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和保肝等多种生物活性[4]。对天山堇菜秦皮乙素的研究仅限于其含量测定及抗肿瘤活性筛选研究[3,5]，其提取纯化工艺尚未见报道。大孔树脂具有吸附容量大、吸附速度快、再生简便等优点，被广泛用于医药食品行业中有效成分纯化中[6-8]。因此，为了天山堇菜及其成分秦皮乙素的开发，本试验拟以秦皮乙素含量为指标，建立天山堇菜秦皮乙素大孔树脂纯化工艺，以获得富含秦皮乙素的提取物，同时分析其吸附动力学和热力学特征，为天山堇菜进一步研究提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天山堇菜：批号160601，亳州市华云中药饮片有限公司；

秦皮乙素对照品：批号110741-201708，中国食品药品检定研究院；

HPD100A、HPD400、HPD500、HPD750、NKA、X-5、D101、AB-8型大孔吸附树脂：天津南开大学化学厂；

甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；

其他试剂：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：LC-10ATvp型，日本岛津公司；

电子天平：AL204型，美国梅特勒—托利多仪器有限公司；

超声清洗机：AS10200AD型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；

小型粉碎机：ST-02A型，永康市帅同工具有限公司；

水浴恒温振荡器：SHA-B型，金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 天山堇菜提取液的制备 准确称取石油醚脱脂粉碎后的天山堇菜药材360 g，以30倍量95%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，浓缩至无醇味，用水反复混悬溶解过滤，滤液定容至600 mL，即得样品溶液，测定秦皮乙素的浓度，备用。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取秦皮乙素对照品0.008 6 g，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得浓度为0.172 0 mg/mL 的对照品溶液。

1.3.3 树脂的预处理 称取HPD100A、HPD400、HPD500、HPD750、NKA、X-5、D101和AB-8型树脂适量，加入95%乙醇，浸泡24 h，装柱，梯度乙醇洗脱至洗脱液和水混合不出现白色浑浊为止，用蒸馏水洗至无醇味，备用。

1.3.4 天山堇菜秦皮乙素的测定 色谱柱：Phenomenex Gemini-NX C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.1% 磷酸水溶液—甲醇(体积比70∶30)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长258 nm；进样量10 μL。精密量取对照品溶液0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，摇匀后HPLC测定，以峰面积对秦皮乙素标准溶液的浓度(μg/mL)绘制标准曲线：A=14 955X+14 853，r=0.999 5，线性范围3.44～137.60 μg/mL。

1.3.5 不同型号树脂的筛选 分别称取0.5 g处理好的各种型号树脂于25 mL具塞锥形瓶中，加入供试品溶液稀释成0.206 8 mg/mL的溶液10 mL，25 ℃水浴恒温振荡器(频率为120 r/min)中振摇吸附24 h，过滤，各取10 μL 按1.3.4测定秦皮乙素浓度。抽干树脂表面水分，加入95%乙醇溶液10 mL，相同条件下振摇24 h，各取10 μL 测定秦皮乙素含量，分别按式(1)、(2)计算吸附率和解吸率。

(1)

(2)

式中：

R1——吸附率，%；

R2——解析率，%；

C0——吸附前秦皮乙素浓度，mg/mL；

C1——吸附后秦皮乙素浓度，mg/mL；

C2——解析液中秦皮乙素浓度，mg/mL；

V1——样液体积，mL；

V2——解析液体积，mL。

大孔树脂的特性如表1。

1.3.6 静态吸附动力学试验 称取最佳树脂5.0 g于250 mL 具塞锥形瓶中，加入供试品溶液稀释成0.103 4 mg/mL 的溶液100 mL后，置于120 r/min，温度298 K恒温振荡器中振荡吸附12 h。分别于0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0，12.0 h吸取0.5 mL上清液，并通过HPLC测定秦皮乙素浓度，按式(3)计算树脂的吸附量，并绘制HPD500对秦皮乙素的静态吸附动力学曲线。

(3)

表1 大孔吸附树脂的物理性质

式中：

R3——吸附量，mg/g；

C0——吸附前秦皮乙素浓度，mg/mL；

C1——吸附后秦皮乙素浓度，mg/mL；

V1——样液体积，mL；

m——树脂质量，g。

1.3.7 吸附等温线和吸附热力学 分别称取最佳树脂0.5 g 置于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入10 mL浓度为0.051 7，0.103 4，0.155 1，0.206 8，0.258 5，0.310 2，0.361 9，0.413 6 mg/mL系列溶液，分别在298，308，318 K 恒温振荡器中以120 r/min振摇24 h，使其达到吸附平衡，测得不同温度下的吸附等温线，并计算样品的平衡浓度、大孔树脂的平衡吸附量。

1.3.8 大孔树脂的动态吸附与解析试验

(1) 上样浓度的影响：分别称取5份HPD500树脂10.0 g装入玻璃柱(φ20 mm×500 mm)(各因素考察均以此法装柱)，以2.0 mL/min的流速各加入浓度为0.866 2(50 mL)，1.732 5(25 mL)，2.593 5(16.7 mL)，3.464 9(12.5 mL)，4.331 2(10 mL) mg/mL的提取液，用7 BV水洗脱，测定秦皮乙素含量并计算吸附量。

(2) 最大上样量的选择：以2.0 mL/min的流速将浓度为2.593 5 mg/mL样液缓缓加入树脂柱中，每10 mL收集一流份，测定流出液中秦皮乙素的含量，以考察树脂的最大吸附量。

(3) 上样流速的确定：以1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min的流速分别加入2.593 5 mg/mL样液30 mL，用7 BV水洗脱，测定秦皮乙素含量并计算吸附量。

(4) 除杂用水量的确定：以2.0 mL/min的流速分别加入2.593 5 mg/mL溶液30 mL充分吸附，用水洗脱除杂，每一柱体积收集一流份，浓缩干燥，称重。

(5) 洗脱剂浓度的确定：以2.0 mL/min的流速分别加入浓度为2.593 5 mg/mL溶液30 mL，上样完成后，用7 BV蒸馏水除杂，再以10%，30%，50%，70%，95%乙醇洗脱。收集洗脱液，减压浓缩干燥，按式(4)、(5)计算纯度和回收率。

(4)

(5)

式中：

R4——回收率，%；

R5——纯度，%；

M1——洗脱液中秦皮乙素含量，mg；

M2——上样液中秦皮乙素含量，mg；

M3——浓缩干燥后质量，g。

(6) 洗脱剂用量的确定：以2.0 mL/min的流速分别加入浓度为2.593 5 mg/mL溶液30 mL，用7 BV蒸馏水除杂，再以50%乙醇洗脱，每一个柱体积收集一个流份，测定含量，绘制洗脱曲线。

(7) 洗脱流速的确定：以2.0 mL/min的流速分别加入浓度为2.593 5 mg/mL溶液30 mL，用7 BV蒸馏水洗脱除杂，再用7 BV 50%乙醇以1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/min流速洗脱，测定含量，计算回收率。

(8) 验证实验：按最佳条件以2.0 mL/min的流速分别加入浓度为2.593 5 mg/mL样液30 mL，平行3份，然后用7 BV蒸馏水除杂，再用7 BV 50%乙醇以2.0 mL/min流速洗脱，收集50%乙醇洗脱液，计算回收率和纯度。

2 结果与分析

2.1 不同型号大孔树脂的筛选

树脂的吸附量受被吸附物质的特性、树脂的比表面积、孔结构及极性等因素影响。孔径小的树脂有利于吸附分子质量较小的物质，HPD500树脂孔径5.5～7.5 nm，在所筛选8种树脂中最小，秦皮乙素为小分子化合物(相对分子量为178.14)。由表2可知，HPD500树脂对天山堇菜秦皮乙素有较好的吸附与解吸附效果，吸附率和解吸率分别达到了87.76%，86.82%。因此，选择HPD500树脂为该化合物纯化的最佳树脂。

表2 不同型号大孔树脂对秦皮乙素的吸附与解吸附情况

2.2 静态吸附动力学曲线

溶质在溶液体系中进行吸附时，溶剂、溶质对吸附剂进行竞争，假设溶剂的吸附可忽略时，吸附体系可用单组分吸附来处理。静态吸附动力学曲线显示了吸附剂对溶质的吸附量随时间的变化过程[9]。如图1所示，5 h内HPD500树脂的吸附量不断增加；5 h后，HPD500树脂的吸附量已基本保持平衡。因此，HPD500树脂对天山堇菜秦皮乙素的吸附时间为5 h。

2.3 HPD500树脂对秦皮乙素的吸附动力学模型

大孔树脂对有效成分的吸附为物理过程，主要通过范德华力或者氢键进行。为阐明吸附机理，分别将拟一级、拟二级动力学模型应用于结果的分析讨论中[10]。

图1 298 K时HPD500树脂对秦皮乙素的静态 吸附动力学曲线

拟一级动力学模型的表达式：ln(qe-qt)=lnqe-k1t，

(6)

通过取对数变换为qt=qe(1-e-k1t)，

(7)

(8)

式中：

qt——某一时间的吸附量，mg/g；

qe——平衡吸附量，mg/g；

k1——拟一级动力学模型的速率常数；

k2——拟二级动力学模型的速率常数。

以qt为纵坐标对t作图，可判断反应是否符合拟一级动力学规律并求得反应系数k1。

以t/qt对t作图，可判断反应是否符合拟二级动力学规律并求得反应系数k2。

由表3可知，拟二级动力学方程能更好地描述HPD500树脂对秦皮乙素的吸附过程，相关系数R2为0.999。

进一步用粒子扩散动力学Kannan方程(qt=k3t0.5+C，式中k3，C为常数)分析结果，以t0.5为横坐标，qt为纵坐标，拟合动力学试验数据[11]。由表3可知，粒子扩散动力学Kannan方程不适合描述整个吸附过程，吸附速率的控制步骤除颗粒内扩散外，可能还存在边界层扩散和液膜扩散等其他吸附作用。

表3 HPD500型大孔树脂对秦皮乙素吸附量的动力学参数

2.4 静态吸附热力学考察

由图2可知，随着秦皮乙素质量浓度增加，吸附等温线逐渐趋于平缓。随着温度的升高，qe降低，表明低温有利于吸附，HPD500树脂吸附秦皮乙素是个放热过程。

等温吸附模型的拟合常用Langmuir和Freundlich方程[12]。Langmuir模型为单分子层吸附过程，假定吸附剂的表面分布是均匀的、且吸附物之间无相互作用，该模型比较适合解释单层吸附，即吸附作用仅发生在吸附剂的外表面。Freundlich模型不仅能用于单层吸附，还能用于不均匀表面的吸附情况，能很好地解释试验结果。

图2 HPD500型大孔吸附树脂对秦皮乙素的 吸附等温线

(9)

(10)

式中：

qe——平衡吸附量，mg/g；

Ce——平衡浓度，mg/mL；

qm——饱和吸附量，mg/g；

KL——Langmuir常量；

KF、n——Freundlich常数。

由表4可知，随着温度的升高，KF，KL，qm都降低，表明此吸附为放热过程，低温有利于吸附。Freundlich方程的相关系数R2接近于1，说明HPD500树脂对秦皮乙素的等温吸附更符合该方程，也说明秦皮乙素在HPD500上的吸附是非均匀的多层吸附。n>1，说明该吸附为“优惠吸附”，具有较强的吸附能力。

2.5 吸附热力学参数的计算

吸附热力学参数包括吸附焓变(△H)、吸附自由能变(△G)和吸附熵变(△S)。按文献[13-14]的方法计算热力学参数。等量吸附焓变△H和树脂吸附量有密切关系，Van’t Hoff方程：

表4 两个方程拟合参数

ln(1/Ce)=lnK0+(-△H/RT)，

(11)

式中：

K0——Van’t Hoff方程常数；

R——理想气体常数8.314 J/(mol·K)。

△H按式(11)计算，以ln(1/Ce)对1/T作图，通过拟合方程计算△H。

吸附自由能△G可通过Gibbs方程从吸附等温线衍生计算得式(12)：

(12)

式中：

q——吸附量，mg/g；

x——溶液中吸附质的摩尔分数。

(13)

将式(13)代入式(12)得式(14)：

△G=-nRT，

(14)

式中：

n——Freundlich方程中的参数。

说明△G与吸附量q无关。

吸附熵△S按式(15)算：

Gibbs-Helmholtz方程：△S=(△H-△G)/T。

(15)

由表5可知，不同初始浓度下的△H均<0，表明吸附为放热过程，与吸附等温线得出的结论一致。△G均<0，说明树脂吸附秦皮乙素是自发的，且随温度的升高，△G逐渐增大，自发程度减小，升温不利于吸附。△G和△H的绝对值分别<20、40 kJ/mol，说明吸附为物理过程[15-16]。△S始终<0，说明吸附后溶液体系的混乱程度降低，可能由于溶质分子被吸附到树脂表面上而导致溶质分子在溶液中的自由度降低。

2.6 大孔树脂动态吸附与解析

2.6.1 单因素试验 由图3(a)可知，当上样浓度<2.593 5 mg/mL时，随浓度的增大，吸附量逐渐增加；超过2.593 5 mg/mL时，吸附量下降。因此，选择最适的上样浓度为2.593 5 mg/mL。由图3(b)可知，当上样体积为30 mL(即两个柱体积，2 BV)时，有少量的秦皮乙素泄漏，

表5 HPD500树脂吸附秦皮乙素的热力学参数

图3 大孔树脂动态试验结果

超过30 mL，出现大量泄漏。通过换算，确定最大上样量为7.780 5 mg/g·树脂。如图3(c)所示，随着流速的增大，吸附量不断降低，秦皮乙素未被吸附就洗脱。上样流速小，化合物能被树脂充分地吸附。考虑时间成本因素，选择上样流速为2.0 mL/min。由图3(d)可知，除杂用水量增加，所得杂质的质量明显减少；达到7 BV时，杂质的质量变化很小，绝大部分杂质已被洗脱下来。故选取7倍量的蒸馏水除杂。由图3(e)可知，乙醇浓度越高，回收率较高，可能是由于秦皮乙素分子量小，脂溶性较大。乙醇浓度>50%时，其浓度越高，洗脱下的杂质越多，纯度也越低。故洗脱溶剂确定为50%乙醇。由图3(f)可知，7 BV 的50%乙醇溶液可将秦皮乙素几乎全部洗脱下来。故选择7 BV的50%乙醇洗脱。如图3(g)所示，洗脱流速过快，越不利于秦皮乙素的洗脱，其回收率逐渐减小。因此，选取2.0 mL/min为洗脱流速。

2.6.2 验证实验 在最佳条件下，秦皮乙素的平均回收率为93.32%，RSD为1.20%；平均纯度为37.16%，RSD为0.56%，说明优选的工艺稳定可行。

3 结论

HPD500树脂对秦皮乙素具有较高的吸附率和解吸附率；吸附过程符合Freundlich等温方程，降温有利于吸附；吸附是一个自发(G<0)、放热(H<0)的物理过程。熵变S<0，表明吸附为熵减的过程；吸附动力学符合拟二级动力学方程，相关系数为0.999，能有效反映HPD500树脂对秦皮乙素的吸附过程。动态试验结果显示，天山堇菜秦皮乙素上样浓度2.593 5 mg/mL，最大上样量7.780 5 mg/g·树脂，上样流速2.0 mL/min，除杂水量7 BV，7 BV 50%乙醇溶液洗脱，洗脱流速2.0 mL/min时，解吸率可达93.32%，所得提取物中秦皮乙素含量由上样前的0.90%提高到37.16%，提高了41倍。以上试验结果表明，该工艺成本低、简单易操作，适用于天山堇菜秦皮乙素的工业化大生产。后续可通过各种色谱技术进一步探索建立从提取物中获得高纯度秦皮乙素的纯化方法。