乳酸菌、酵母菌的筛选鉴定及其在米发糕中的应用

李美伦 - 姜萌艺 - 龚川杰 - 何 利

(四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

米发糕的传统生产方式是在新鲜米浆中接入老浆进行发酵[1-2]，发酵过程中微生物体系的菌种比例和活性难以控制，会导致其生产周期延长且产品质量不稳定[3][4]9。

在淀粉食物原料的发酵过程中，优势菌主要为酵母菌和乳酸菌，两者可进行协同发酵并对产品的风味和营养成分的形成起着重要作用[1,3,5-6]。目前，对米发糕发酵剂的研究多为双菌发酵剂[7-8][9]32-42，该种发酵剂与老浆发酵相比仍有一定差距，因而米发糕发酵剂的菌种组成还有待进一步优化。发酵制品中的微生物组成与地理位置有很大联系[10]，目前尚未见有关中国四川地区米发糕的研究报道。本试验拟以四川雅安地区的传统发酵米浆为研究对象，对其中具有良好发酵性能的乳酸菌和酵母菌进行筛选，并用作米发糕的复合发酵剂，以期为米发糕的标准化、规模化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

传统发酵米浆：采自四川省雅安市雨城区消费者评价较好的米发糕作坊，共5份；

早籼米、白砂糖：均购于四川省雅安市吉选超市；

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH (6.2±0.2)，固体培养基加琼脂15～20 g，碳酸钙15 g，121 ℃灭菌20 min；

麦芽汁培养基：麦芽浸出粉130 g，氯霉素0.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH (6.0±0.2)，固体培养基加琼脂15～20 g，121 ℃灭菌20 min[11]；

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、麦芽浸粉：生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；

PCR反应试剂、DNA Marker：生工生物工程 (上海) 股份有限公司；

其他试剂：分析纯，雅安市万科化学试剂公司。

1.1.2 主要仪器设备

PCR仪：C1000型，美国Bio-Rad公司；

冷冻离心机：D-37520型，美国Thermo公司；

物性分析仪：TA-XT plus型，英国Stable Micro systems公司；

气相色谱—质谱联用仪：7890A-5975C型，美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株筛选

(1) 分离：取米浆样品进行梯度稀释并分别涂布于MRS培养基和麦芽汁培养基，MRS培养基于37 ℃(麦芽汁培养基于28 ℃)培养48 h。分别挑取具有溶钙圈及不同菌落特征的疑似乳酸菌菌落和具有不同菌落特征的疑似酵母菌菌落进行划线纯化。

(2) 筛选：对疑似乳酸菌进行革兰氏染色和菌株形态观察，选择具有典型乳酸菌特征的菌株进行斜面保藏和甘油管冷冻保藏(菌液和60%甘油按1∶1的体积比接入甘油管内并置于实验室-80 ℃冰箱内)。对疑似酵母菌进行水浸片镜检，选择具有典型酵母菌特征和良好产气性能的菌株进行斜面保藏和甘油管冷冻保藏(与乳酸菌菌种保藏方法一致)。

1.2.2 分子生物学鉴定 将筛得的乳酸菌划线至MRS培养基，37 ℃培养24 h，酵母菌划线至麦芽汁培养基，28 ℃ 培养24～48 h。乳酸菌16S rDNA鉴定选用细菌通用引物27F和1492R[12]，酵母菌26S rDNA鉴定选用真菌通用引物NL1和NL4[13]，均以挑取单菌落至7 μL无菌水中得到的菌液为模板进行扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行测序。将所得序列在NCBI数据库中进行Blast比对，选择相似度较高的序列，采用MEGA 5.0软件构建菌株的系统发育树。

1.2.3 菌株生长性能测定 将活化后的乳酸菌菌液按2%的接种量接入MRS液体培养基(酵母菌菌液按同样接种量接入麦芽汁培养基)，在0～24 h时，每隔2 h测定菌液在600 nm处的OD值，以空白培养基为对照。

1.2.4 液体复合发酵剂的制备 将培养至对数生长末期的菌液(乳酸菌浓度为108CFU/mL，酵母菌浓度为107～108CFU/mL)，离心(4 000 r/min，30 min)，用0.9%的生理盐水使菌体复悬，备用[9]22-23。经预试验确定出植物乳杆菌分别与酿酒酵母菌、矮小假丝酵母菌的复配体积比为1∶9时，发酵得到的米发糕具有良好的感官和质构特性。因此在已经确定植物乳杆菌与酵母菌比例的基础上，确定植物乳杆菌、酿酒酵母和矮小假丝酵母菌悬液体积比为1.0∶1.8∶7.2，1.0∶3.0∶6.0，1.0∶4.5∶4.5，1.0∶6.0∶3.0，1.0∶7.2∶1.8(依次对应1～5号)的比例进行复配，制备液体复合发酵剂。

1.2.5 米发糕的制作 根据文献[4]36修改如下：早籼米在30 ℃下浸泡21 h，沥水后磨成米粉并过60目筛，将所得米粉与水按8∶2的质量比混匀得到米浆。以米浆量为基准，接入体积分数为5%的复合发酵剂和6 g/100 mL的白砂糖后搅匀，于35 ℃发酵12 h，发酵结束后，再加入14 g/100 mL 的白砂糖进行调味，得到发酵米浆。将米浆定量盛入模具内，沸水蒸20 min，得到米发糕。

1.2.6 感官评定 感官评定小组由10人组成。感官评价标准参考文献[4]21制订，见表1。

1.2.7 质构特性测定 采用P/36 R探头对样品进行TPA测定，参数设置参考文献[14]。

1.2.8 米发糕风味物质的测定 色谱条件根据文献[9]43-44进行设定，定量定性分析：将GC-MS图谱用NIST.11谱库进行检索，仅报告匹配度>80%的鉴定结果并采用面积归一化法计算样品中各组分的相对含量。

1.2.9 数据处理 用Excel 2010绘制图表，用 SPSS 19.0进行数据分析，显著性分析采用Duncan检验，P<0.05判定为显著性变化。

2 结果与分析

2.1 鉴定结果

2.1.1 菌落及菌株形态特征 对米浆样品中的疑似乳酸菌进行分离纯化获得12株具有溶钙圈的纯菌株，其中2株为革兰氏阳性菌且具有典型的乳酸菌菌落及菌株形态特征，将其分别编号为R-1a、R-2b。对米浆样品中的疑似酵母菌进行分离纯化获得7株纯菌株，其中5株具有酵母菌典型的菌落、菌株形态特征且在培养过程中发现其均具有良好的产气性能，将其分别编号为J-1a、J-2a、J-3a、J-4a、J-5a。菌落及菌株形态特征见表2。

表1 感官评价表

2.1.2 分子生物学鉴定 经Blast相似性检测发现，R-1a和R-2b与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的同源性均为99%，故将其鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，但R-1a和R-2b的基因序列有所不同；J-1a、J-4a和J-5a与矮小假丝酵母菌(Candidahumili)的同源性均为99%且基因序列相同，故将其鉴定为矮小假丝酵母菌(Candidahumili)；J-2a和J-3a与酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的同源性均达100%且基因序列相同，故将其鉴定为酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。菌株的系统发育树见图1。根据菌落、菌株形态特征及鉴定结果，选择R-1a、R-2b和J-1a、J-2a进行后续试验。

2.2 菌株生长特性

菌株24 h内的生长曲线见图2。R-1a和R-2b在24 h内生长速率相当，将其分别与筛得的酵母菌复配进行发酵预试验发现，发酵得到的米发糕的感官品质差异不明显，因此选用其中1株乳酸菌作为米发糕发酵剂复配菌株之一。在0～10 h时J-2a生长速率明显快于J-1a，2株酵母菌大致在10 h后进入稳定期，其中J-2a在稳定期内的OD 值高于J-1a。虽然矮小假丝酵母常存在于发酵食品中且被认为是酸面团中较为常见的一种酵母菌[15]，但在中国诸多发酵米浆中微生物菌系的研究中未见报道。有研究[16]表明矮小假丝酵母和酿酒酵母均具有较快的产气速率，但两者单独发酵所得馒头的主要挥发性成分种类不同。因此选择R-2b(植物乳杆菌Lactobacillusplantarum)、J-1a(矮小假丝酵母Candidahumilis)及J-2a(酿酒酵母Saccharom-ycescerevisiae)复配制作米发糕三菌复合发酵剂。

表2 乳酸菌、酵母菌菌落及菌株形态特征

2.3 复配菌比对米发糕感官品质的影响

5组不同复配菌比所得米发糕的感官评价结果见图3、 4。在形态方面，2号米发糕内部孔洞细密均匀，其他4组米发糕内部孔洞大小及分布不均且都不如2号米发糕蓬松；在香气和滋味方面，2号米发糕相较于其他4组米发糕，具有柔和的发酵风味和醇香且酸甜适中；在口感和色泽方面，5组米发糕差异不明显。可能是不同复配菌比会影响酵母菌的产气能力，使得米发糕的内部组织产生差异，同时不同复配菌比会影响到微生物产生的酶及代谢产物对大米淀粉、蛋白质等成分的作用，导致米发糕在气味、滋味方面有较大变化[17]。综合感官评价各项指标可得到2号复配体积比R-2b∶J-2a∶J-1a=1∶3∶6得到的米发糕的感官得分最高。

图2 乳酸菌、酵母菌生长曲线

图3 三菌复配米发糕感官评价单项指标评分

Figure 3 The singer index score of the rice steamed sponge cake by three strains compounded

2.4 复配菌比对米发糕质构特性的影响

根据表3可知，5组不同复配菌比发酵得到的米发糕在回复性上无显著性差异(P>0.05)，在弹性和内聚性上仅3号和5号有显著性差异(P<0.05)，因此选择硬度、胶着性和咀嚼性评价米发糕的质构品质。米发糕的硬度、胶着性和咀嚼性与米发糕的品质呈负相关[18]。随着酿酒酵母占比的增加，米发糕的硬度、胶着性和咀嚼性先减小后增大，当植物乳杆菌、酿酒酵母和矮小假丝酵母的体积比为1∶3∶6时，米发糕的硬度、胶着性和咀嚼性均最小，说明该复配菌比有利于菌株间协同发酵作用，可以改善米发糕的质构品质。

1～5对应复配菌比组号1～5号

2.5 发酵剂对米发糕挥发性风味物质的影响

采用HS-SPME-GC-MS法分析4种米发糕的挥发性风味物质(样品1：发酵剂为植物乳杆菌与矮小假丝酵母按1∶9的体积比复配；样品2：发酵剂为植物乳杆菌与酿酒酵母按1∶9的体积比复配；样品3：发酵剂为植物乳杆菌、酿酒酵母和矮小假丝酵母按1∶3∶6的体积比复配；样品4：市售老浆发酵米发糕)。

由表4、5可知，4种米发糕中共同检出的风味物质有5种，包括苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、十四烷和棕榈酸乙酯。4种样品中相对含量最多的均为醇类，主要是苯乙醇，这与吴鹏[9]49研究的结果一致，苯乙醇具有新鲜面包香及玫瑰香，是米发糕、馒头的重要呈香物质[19-20]。

表3 不同菌比米发糕的质构及感官评价结果†

† 同列数据后无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。

样品1、2、3及4中分别检出16，17，29，13种挥发性风味物质，不同样品中的风味物质有所差异，主要表现在酸类、醇类、醛类、酯类等物质上。样品1中酸类和醛类的相对含量明显高于样品2中的，但其醇类物质的相对含量明显低于样品2的，其中乙酸、苯乙醛以及样品2中特有的2,3-丁二醇是造成差异的主要原因，可能是发酵所用的酵母菌不同引起的。尽管样品1、2中醇类和酸类的相对含量都较高，但酯类物质的含量均较低，由此可知醇类与酸类物质的含量并不与酯类物质的含量呈正比[21]。与样品1、2相比，样品3中酸类和醇类物质的相对含量明显减少，但酯类物质相对含量和种类显著增加，可能是矮小假丝酵母菌和酿酒酵母菌之间存在协同作用促进了酯类物质的生成。酯类物质的阈值较低是影响食品风味的重要成分[22]，样品1、2和3中共同检出了4种酯类物质，包括乙酸苯乙酯(玫瑰香和果香[22])、癸酸乙酯(葡萄香气)、辛酸乙酯和棕榈酸乙酯(花果香、奶香[23])。此外，样品3中还检出9种特有的酯类物质，包括棕榈酸甲酯(微弱的蜡香、果香和奶油香[23])、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚油酸乙酯(均具有油脂香气[23])以及α-戊基-γ-丁内酯(果香)等。这些酯类物质可赋予米发糕果香和奶香。

与样品3相比，市售米发糕中醛类和呋喃类物质的相对含量更多，但酸类和酯类物质的种类和相对含量明显减少，可能是2种样品发酵时微生物体系有较大差异(如菌种组成及菌比的不同)造成的。此外，对样品3、4进行感官评价，结果见表6。样品3的感官得分高于样品4，同时受试人员反映三菌复合发酵得到的米发糕酸甜适宜并有回味，香气适宜且具有柔和的发酵味和醇香味，而市售米发糕的滋味略偏酸，香气较淡。结合GC-MS测定结果可知，与其他3种米发糕相比，三菌复合发酵剂得到的米发糕所含的挥发性风味物质种类更为丰富，但这些风味物质与产品香气、滋味的关系还有待进一步研究。

图5 4种米发糕GC-MS总离子流图

表4 米发糕挥发性风味成分及含量†

† “—”为未检出。

表5 不同米发糕样品中挥发性风味物质类别统计结果

表6 与市售样品的感官品质对比

3 结论

本试验从四川雅安地区的传统发酵米浆中筛选得到3株能够复配用于米发糕发酵的菌株，经测序分析确定分别为植物乳杆菌、酿酒酵母菌和矮小假丝酵母菌。研究发现当三菌复配体积比为R2-b∶J-2a∶J-1a=1∶3∶6时，发酵得到的米发糕具有最优的感官品质和质构特性，并由GC-MS检测到29种挥发性风味物质，与双菌复合发酵剂和老浆发酵的米发糕相比，该种米发糕所含的风味物质更为丰富，尤其是酯类物质，同时与市售米发糕相比，其还具有更优的感官品质。基于以上研究，植物乳杆菌、酿酒酵母菌及矮小假丝酵母菌作为复合发酵剂可用于米发糕的生产。

本试验还对比分析了2种酵母菌对米发糕风味的影响，补充了矮小假丝酵母菌在米发糕中应用的研究。但植物乳杆菌、酿酒酵母菌及矮小假丝酵母菌对米发糕风味物质影响的机理，还有待进一步研究。