原生态壳聚糖膜的结构与性能研究

邢晓露

(青岛大学 纺织服装学院，山东 青岛266071)

壳聚糖是甲壳素部分或全部脱乙酰基的产物，化学名为β-(1-4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖[1]，广泛存在于甲壳纲动物虾和蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌的细胞壁和植物(如蘑菇)的细胞壁中，在食品、医药、农业、化妆品等方面具有广泛的用途[2]。 壳聚糖因其良好的抑菌性、吸附性、生物相容性、生物降解性、可塑性、可修饰性等性能，近年来，在生物医学工程领域特别是在医用敷料、药物载体、组织工程支架等方面取得突破性进展。 关于壳聚糖的结构性能，从上个世纪90 年代开始已经有了大量研究，但是大部分研究都是将虾蟹壳看成是一个片状材料，在应用时，也是将其粉粹后做溶解等处理，很少去关注蟹壳本身的微观结构。 关于壳聚糖膜在医学方面的应用研究，主要集中于将壳聚糖静电纺丝制得膜[3]、凝胶化干燥制得膜[4]等，而不是直接制得壳聚糖生物膜。 本文以原生的梭子蟹和阿拉斯加雪蟹的壳为原料，从中提取出片状壳聚糖生物膜，并对其结构和性能做了系统性研究。 原生态的壳聚糖膜天然、环保，具有独特的结构且强力高，在用于骨组织工程、脑内膜、美容整形、仿生骨膜、防术后黏连膜等领域更具有优势。

1 壳聚糖膜的制备及理化性能测试

1.1 试验材料与试剂

梭子蟹壳；阿拉斯加雪蟹壳；盐酸；氢氧化钠；冰乙酸；氯化钠；甲基橙—苯胺蓝指示剂。

1.2 主要仪器和设备

SHZ-82 水浴恒温振荡器(金坛市天竟实验仪器厂)，DPCSB-03 型多频超声波发生器(青岛大学)，zh13101-2 型电热鼓风干燥箱(山东张店电热仪器厂)，PHS-2C 型酸度计(上海理达仪器厂)，箱式电阻炉(上海索域试验设备有限公司)，NDJ-8S 旋转粘度计(上海昌吉地质仪器有限公司)，乌氏粘度计(上海晶菱玻璃有限公司)，台式电子扫描显微镜(phenom pro .Netheland)，TG 209 F3 Tarsus 热重分析仪(德国耐驰仪器制造有限公司)，Rigaku Ultima X 射线衍射仪(Rigaku Corporation)。

1.3 制备方法

Benhabiles MS[5]等研究了不同反应条件下蟹壳中甲壳素的制备，得出脱钙反应的条件在盐酸溶液浓度1.5 N、时间30 min、温度常温、浴比1：15 为最佳，脱蛋白反应的条件在氢氧化钠溶液浓度2 N、时间2 h、温度45 ℃、浴比1 ∶20 为最佳；蔚鑫鑫[6]等研究了从小龙虾中提取壳聚糖的工艺，得出最佳工艺条件为：采用室温下1 mol/L 的盐酸溶液浸泡24 h，用2 mol/L 的氢氧化钠溶液在90℃～100℃反应4 h，用质量分数50 %的氢氧化钠溶液于90 ℃中水浴3 h；Chae K S[7]等研究了蟋蟀中壳聚糖的提取，采取了如下工艺：用浓度为1 M 的氢氧化钠溶液在95 ℃反应6 h，用草酸溶液在室温下搅拌3 h，用质量分数为50 %～67 %的氢氧化钠溶液在95 ℃条件下反应。 刘伦杰[8]用浓度为5 %的氢氧化钠溶液在85 ℃下浸泡4 h，然后用浓度为3%的盐酸溶液在30 ℃下浸泡了18 h，最后用浓度为40 %的氢氧化钠溶液在90 ℃下处理12 h，从蚕蛹中提取出了壳聚糖。 结合上述文献中探索出的实验条件，经过试验探索，形成以下工艺条件：

(1)将蟹壳洗净，去除壳上的杂质、污垢，然后用超声波发生器进行超声洗涤，放入烘箱中60℃烘干并称重。

(2)脱钙反应：考虑到完整的蟹壳所占的体积和质量较大，以试剂能够浸没过试样为准，并结合不同浴比得到的产率，将蟹壳按照1：25 的浴比浸泡于7 %的盐酸溶液中，在室温下浸泡16 h，进行脱钙处理，然后用蒸馏水洗至中性，烘干、称重。

(3)脱蛋白反应：将脱钙后的蟹壳按照1：70的浴比浸泡于10 %的氢氧化钠溶液中，将烧杯置于80 ℃下的水浴恒温振荡器中振荡5 h，进行脱蛋白反应，即可得到甲壳素，然后用蒸馏水洗至中性，烘干、称重。

(4)脱乙酰基反应：将甲壳素按照1：80 的浴比置于50 %的氢氧化钠溶液中，120 ℃下加热5 h，进行脱乙酰基反应，即可得到壳聚糖，然后用蒸馏水洗至中性，烘干、称重。

1.4 理化性能测试

1.4.1 脱乙酰度测试

依据行业标准FZ/T 50037-2017 壳聚糖纤维脱乙酰度试验方法，采取酸碱滴定法进行测试。

称取0.2 g ～0.3 g 样品，加入0.1 mol/L 标准盐酸溶液30 mL，在常温下搅拌至完全溶解后，加入2 滴甲基橙—苯胺蓝指示剂。 滴入0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液，当溶液变为蓝绿色时，即为滴定终点，读取氢氧化钠标准滴定溶液的滴定体积。 最后根据下列公式进行脱乙酰度计算：

式中：D 为脱乙酰度(%)；c1为盐酸标准滴定溶液的物质的量浓度(mol/L)；V3为加入盐酸标准滴定溶液的体积(mL)；c2为氢氧化钠标准滴定溶液的物质的量浓度(mol/L)；V4为滴定所消耗的氢氧化钠标准滴定溶液的体积(mL)；m 为已测壳聚糖的质量(g)。

1.4.2 溶解性测试

将壳聚糖溶解于1 %的冰乙酸中，将未溶解的剩余物洗净并烘干称重，溶解的壳聚糖高聚物质量占原始质量的百分比即为溶解度。

1.4.3 灰分测定

依据KUMARI S[9]等测定灰分的方法，在坩埚中称取2 g～5 g 壳聚糖样品，放入电炉中于550 ℃灼烧3 h，取出，冷却30 min，称重。 再放入电炉中灼烧1 h，冷却称重，反复灼烧至恒重，计算样品中的灰分含量：

式中：X 为样品的灰分含量(%)；m1为坩埚与样品的总质量(g)；m2为坩埚与灰分的总质量(g)；m3为灼烧至恒重时的坩埚质量(g)。

1.4.4 粘度测定

依据国家标准GB 29941-2013 食品添加剂 脱乙酰甲壳素(壳聚糖)，在室温下称取烘干至恒重的试样3.0 g，加入到300 mL 水中，然后加入冰乙酸3.0 g，搅拌至试样充分溶解，用旋转式粘度计测定其粘度。

1.4.5 相对分子量测定

采用粘度法[2]测定壳聚糖的相对分子量，由特性粘度[η]来计算分子量。 称取1 g 壳聚糖样品，用0.1 mol/L 乙酸-0.2 mol/L 氯化钠溶剂配成50 mL 样品溶液，浓度为c1，将其倒入粘度计的粗管中，在25 ℃水浴中保温10 min。 堵住粗管口，用吸耳球从细管口吸气，使溶液逐渐上升至上刻度线以上，然后松开手指、移走吸耳球，使样品溶液在细管内自然下落，记录通过上下刻度线间的时间t1；然后量取5 mL 溶剂加入粘度计中，此时浓度为c2，时间为t2，再依次量取5 mL 和10 mL 溶剂分别加入粘度计中，浓度分别为c3和c4，时间分别为t3和t4，测定溶剂粘度时的时间为t0。 对应于各浓度的相对粘度[ηr]为：

增比粘度＝ηr-1，比浓粘度为ηsp/c。

将得到的4 个比浓粘度对浓度作图，可得到一条直线，将直线延长至与纵坐标相交，截距即为特性粘度[η]。 根据Mark-Houwink 公式 η[ ] ＝K Ma可计算得到壳聚糖的分子量M。

1.5 壳聚糖膜的表征测试

1.5.1 截面及内表面形貌测试

将片状壳聚糖膜沿着横向和纵向切断，切取横向切片和纵向切片，每一个样品都检测其横截面和纵截面，并直接检测其内表面的形态，借助扫描电子显微镜，将样品用导电胶粘到实验圆台上，做好标记，然后对其进行表面喷金，采用5 KV 的加速电压进行检测，在不同的放大倍数下观察壳聚糖膜的微观形貌。

1.5.2 结晶度测试

借助X 射线衍射仪，实验采用铜靶，管压为40 KV，管流为40 mA， 扫描的角度范围为5 °-85 °，扫描速度为2 s-1。

1.5.3 热稳定性测试

采用TG 209 F3 Tarsus 热重分析仪对壳聚糖膜进行热重分析，氮气气氛保护，温度范围为35 ℃-800 ℃，加热速度为10 K/min。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖膜的理化性能

2.1.1 脱乙酰度

脱乙酰度的大小是衡量壳聚糖制备是否成功以及壳聚糖性能好坏的重要指标，直接影响到溶解度、粘度等性能，因此，壳聚糖脱乙酰度的测定极为重要。

根据脱乙酰度的计算公式，进行多次重复试验后取平均值，得到梭子蟹壳聚糖的脱乙酰度为96.5 %，阿拉斯加雪蟹壳聚糖的脱乙酰度为81 %。在相同的实验条件下，两种壳聚糖的脱乙酰度均达到80 %以上，且梭子蟹壳聚糖较阿拉斯加雪蟹壳聚糖的脱乙酰度高，这说明制备壳聚糖膜时，不同的来源是影响脱乙酰度的一个重要因素。

2.1.2 溶解性能

壳聚糖的溶解性主要取决于其生物来源、分子量和脱乙酰度。

将壳聚糖膜溶解于1 %的冰乙酸中，发现没有未溶解的剩余物，即壳聚糖膜全部溶解，溶解性能良好。

2.1.3 灰分

根据行业标准SC/T 3403-2004 甲壳质与壳聚糖，壳聚糖的理化指标的要求如表1 所示：

表1 壳聚糖的理化指标要求

根据公式计算得到如下结果：梭子蟹壳聚糖膜的灰分为1.5 %，阿拉斯加雪蟹壳聚糖膜的灰分为1.1 %，表明脱钙处理时已去除了绝大多数的无机盐，梭子蟹壳聚糖膜的灰分含量略高于阿拉斯加雪蟹壳聚糖膜的灰分，实验测得的灰分含量均符合工业级壳聚糖的标准要求，但不能用于食品级壳聚糖的应用。

2.1.4 粘 度

粘度的大小反映了分子量的大小，不同粘度的壳聚糖具有不同的应用领域，对壳聚糖的成膜性及壳聚糖纤维的强度有较大影响。

在1 号转子，转速60 r/min 的条件下，旋转粘度计测得的梭子蟹壳聚糖膜的百分计标度为27.6%，表明转子和转速的选择是合适的，此时测得的壳聚糖大分子的粘度为27 mPa·s；阿拉斯加雪蟹壳聚糖膜的粘度为31.2 mPa·s，均属于低粘度壳聚糖。

2.1.5 相对分子量

(1)梭子蟹壳聚糖膜

不同条件下测得的通过乌氏粘度计上下两刻度线之间的时间t0-t4分别如表2 所示：

根据各浓度的相对粘度、增比粘度和比浓粘度，求得：

由此，回归方程为： y^＝b0＋bx ＝2.373 ＋1.129x

检验方程的显著性：

查F 分布临界值表可知，F0.1(1，2)＝8.53＜F，故方程在α ＝0.1 时显著。

当x ＝ 0 时， [ η] ＝ 2.373 × 100 mL/g＝237.3 mL/g

由Mark-Houwink 公式 η[ ] ＝K Ma，其中K ＝1.81×10-3，α ＝0.93，计算可得由梭子蟹壳制得的壳聚糖膜的分子量M＝3.18×105。

(2)阿拉斯加雪蟹壳聚糖膜

不同条件下测得的通过乌氏粘度计上下两刻度线之间的时间t0-t4分别如表3 所示：

表3 雪蟹壳聚糖通过刻度线的时间

根据各浓度的相对粘度、增比粘度和比浓粘度，求得：

查F 分布临界值表可知，F0.01(1，2)＝98.5＜F，故方程在α ＝0.01 时显著。

当x ＝0 时，[η]＝3.06×100 mL/g ＝306 mL/g

由Mark-Houwink 公式 η[ ] ＝K Ma，其中K ＝1.81×10-3，α ＝0.93，计算可得由阿拉斯加雪蟹壳制得的壳聚糖膜的分子量M＝4.18×105。

(3)根据结果可知，由梭子蟹壳和阿拉斯加雪蟹壳制得的壳聚糖膜的分子量分别为3.18×105和4.18×105，阿拉斯加雪蟹壳聚糖膜的分子量略大。

2.2 壳聚糖膜的表征

2.2.1 表观形貌

图1 两种壳聚糖的内表面电镜照片

2.2.1.1 内表面形貌 两种壳聚糖膜在300X 的放大倍数下的内表面形貌及局部放大图像如图1所示。

从图1 中可以看出，壳聚糖膜表面有较小的旋涡状孔洞，孔洞的大小因蟹壳种类的不同而有所差异，梭子蟹壳聚糖的孔洞排列较为规则且孔洞之间间距较小，孔洞的直径也较小，约为15μm；阿拉斯加雪蟹壳聚糖的孔洞间隔较大，孔洞的直径约为30μm，是梭子蟹壳聚糖的2 倍。 这些孔洞可能是蟹进行养料及水分输送的通道。

2.2.1.2 横截面 在7000X 的放大倍数下，梭子蟹壳聚糖和阿拉斯加雪蟹壳聚糖的横截面形貌如图2 所示。

图2 两种壳聚糖的横截面电镜照片

由图2 可以看出，壳聚糖在蟹壳中呈层状叠加结构分布，层与层之间间隔较紧密，且平行于截面。观察到的总厚度约为15μm，层数为50 层左右，即每层的厚度约可达到300 nm，属于纳米级层状壳聚糖生物膜。 在相同的放大倍数下，阿拉斯加雪蟹壳聚糖膜的层数更多，层与层之间的间隔也更加均匀。

2.2.1.3 纵截面 在7000X 的放大倍数下，梭子蟹壳聚糖和阿拉斯加雪蟹壳聚糖的纵截面形貌如图3 所示。

由图3 可以看出，壳聚糖膜的纵截面也呈层状叠加结构，其内表皮层的厚度比横截面的内表皮层略小，且层与层之间的间隔也较横截面小。

2.2.2 结晶性能分析

采用Rigaku Ultima X 射线衍射仪对壳聚糖膜进行的X 射线分析如图4 所示。

图4 两种壳聚糖的X 射线衍射图像

Samuels[10]等研究了壳聚糖的两种晶体形态，分别称为Rorm I(2θ 在10 °左右)和Rorm II(2θ 在20 °左右)，均属于单斜晶系。 从图4 可知，制得的两种壳聚糖膜都具有这两种晶体形态，且显示了非常强的结晶性，属于α-壳聚糖。 阿拉斯加雪蟹壳聚糖膜在2θ ＝10.44 °和20.04 °的位置出现尖锐的衍射峰，梭子蟹壳壳聚糖膜的衍射峰出现在2θ ＝10.44 °和20.1 °的位置，位置较为接近，但阿拉斯加雪蟹壳聚糖膜的结晶度较高。

2.2.3 热稳定性分析

两种壳聚糖膜的热重分析曲线如图5 所示。

图5 两种壳聚糖的热重分析图像

图5 的曲线反映了35 ℃～800 ℃的温度范围内，阿拉斯加雪蟹壳聚糖和梭子蟹壳聚糖质量的失重百分数和温度的关系，从图中可以看出，两种壳聚糖的分解均发生在两个阶段。 第一阶段为50 ℃～130 ℃，该阶段壳聚糖失去结晶水；第二阶段发生在270 ℃～320 ℃，该阶段为主链断裂的过程，最终分解温度在700 ℃左右。 两种壳聚糖的分解温度基本接近，其中，阿拉斯加雪蟹壳聚糖的失重量略小于梭子蟹壳聚糖的失重量。

3 结 论

壳聚糖是一种天然高聚物，具有良好的抗菌性和生物相容性，本文研究了由阿拉斯加雪蟹壳和梭子蟹壳制得的壳聚糖生物膜的性能并进行比较，得到以下结论：

1)探索了制备壳聚糖膜的工艺条件：用7 %的盐酸溶液在室温下浸泡样品16 h 后，用10 %的氢氧化钠溶液在80 ℃下加热样品5 h，最后在50 %的氢氧化钠溶液在120 ℃下高温加热5 h，即可得到脱乙酰度和溶解度较好的壳聚糖膜。

2)制备的原生态壳聚糖膜脱乙酰度良好，均在80 %以上，溶解度均为100 %，属于低粘度壳聚糖，表面有旋涡状的微小孔洞，截面为纳米级层状叠加结构，结晶性也较强。 两种来源制得的壳聚糖膜性能基本接近，但阿拉斯加雪蟹壳聚糖膜的性能略好于梭子蟹壳聚糖膜。