硫化氢对大鼠肢体再灌注损伤后炎症因子和线粒体能量代谢障碍的影响

2019-06-19杨永华杨海龙王溪淳

中国医学科学院学报 2019年2期

杨永华，王伟，胡斌，杨海龙，王溪淳

1九江市第一人民医院骨科，江西九江 3320002湘雅医学院附属第二人民医院骨科，长沙 410008

骨骼肌缺血再灌注损伤是肢体手术治疗过程中十分常见的病理变化[1- 3]。在下肢断肢再植手术、下肢动脉栓塞手术、主动脉瘤手术以及动脉粥样硬化手术等众多下肢外科操作中不可避免地导致了肢体的缺血再灌注损伤。尽管肢体缺血再灌注损伤的发病机制尚未完全弄清，但研究发现缺血再灌注过程所诱发白介素和肿瘤坏死因子等多种炎症因子的急剧释放而形成局部炎性的“瀑布效应”、骨骼肌细胞线粒体能量代谢障碍以及随后发生的细胞坏死及凋亡均有着密切关联[4- 5]。已有研究显示硫化氢能够特异性地清除体内亚硝酸根和羟自由基发挥其拮抗氧化应激作用，且硫化氢可显著减轻心肌、脑组织以及肠等器官的缺血再灌注损伤[6- 7]。现阶段研究显示，外源性H2S补充可以通过降低炎性细胞浸润及炎性细胞因子激活、直接清除氧自由基、增加内源性抗氧化酶系统的活力、降低醛固酮水平而对骨骼肌缺血再灌注后心肌损伤发挥保护作用。本研究的创新之处在于提取骨骼肌细胞线粒体进行线粒体跨膜电位测定及ATP含量检测，以探讨硫化氢对大鼠肢体缺血再灌注导致的骨骼肌损伤的保护作用机制。

材料和方法

实验动物采用购于湘雅医学院实验动物中心的健康、成年雄性Wistar大鼠60只，均为雌性(批号：2018- 0256)，鼠龄相同，体重220～260 g，符合国家二级实验动物标准，常规条件下进行标准饲养。

主要器材和试剂动物手术器械包购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；上海精科原子吸收分光光度计361CRT；自动生化分析仪ADVIA 2400购自上海；SuPerMax- 3100Plus型多功能酶标仪系统购自上海闪谱生物科技有限公司；美国伯乐Basic基础电泳仪购自北京嘉鹏同创科技发展有限公司；Hettich离心机购自北京速达设备维修有限公司；电热恒温箱购自上海智城分析仪器制造有限公司；美国Scientific Industries振荡器购自奥然科技有限公司；奥林巴斯BX53荧光显微镜购自上海创萌生物科技有限公司。硫氢化钠(NaHS)水合 Sigma购自上海联硕生物科技有限公司；水合氯醛溶液(10% w/v)购自上海羽朵生物科技有限公司；青霉素G钠盐购自北京兰博利德商贸有限公司；云南白药粉购自云南白药集团股份有限公司；3%双氧水购自上海生物工程有限公司；10%中性福尔马林液购自上海羽朵生物科技有限公司。

下肢缺血再灌注损伤动物模型制作实验Wistar大鼠自由饮水及摄食，环境温度(25.0±2.0)℃，湿度(60±5)%，12 h光照周期。在手术操作前均禁食12 h，不限饮水。5%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，肌注阿托品0.04 mg，待大鼠翻正反射及角膜反射消失，将大鼠右后肢毛发剪除，将大鼠仰卧位固定于动物实验手术台，2%碘伏消毒右后肢局部皮肤，铺无菌巾单后，切开右后肢处皮肤，显露右侧股动脉，采取Bulldog无创血管阻断技术游离右侧股动脉并用血管夹钳夹，将股动脉游离一段约1 cm，在股动脉的远端监测血压，当血液计读数为零时表明大鼠肢体缺血模型制作成功，连续保持缺血4 h后，打开动脉夹，恢复右侧股动脉血流，监测到血压上升，标志右后肢再灌注成功，术毕，缝合右后肢皮肤。待后续实验。

实验分组选择60只Wistar大鼠。A组为假手术组(Sham组)20只，B组为对照组(缺血-再灌注损伤+生理盐水组)20只、C组为实验组(缺血-再灌注损伤+H2S 组)20只。A组大鼠麻醉完成后仅行手术暴露并游离右侧股动脉，不进行动脉夹闭处理，暴露4 h后经鼠尾静脉缓慢注射1 ml生理盐水；B组大鼠麻醉完成后切开暴露游离右侧股动脉，钳夹4 h后打开行后肢缺血再灌注处理，同时经鼠尾静脉注射1 ml生理盐水；C组大鼠麻醉完成后切开暴露游离右侧股动脉，钳夹4 h后打开行后肢缺血再灌注处理，同时经鼠尾静脉注射含5 μmol/L NaHS的溶液1 ml。3组Wistar大鼠均于再灌注成功后0、3、6、9、12、15 h经左下肢静脉分别采血；于再灌注成功15 h后切开颈动脉放血处死大鼠，并切取Wistar大鼠右后肢的肌肉组织，将骨骼肌组织用冷生理盐水反复冲洗去除残留血液，用于分析测定与线粒体的提取。此外，同时取大鼠肝脏、肺脏和肾脏组织，其处理方法与骨骼肌同。

肢体骨骼肌、肝脏、肺脏和肾脏组织内坏死分解产物测定应用自动化分析仪测定大鼠肢体骨骼肌、肝脏、肺脏和肾脏组织内肌红蛋白(myoglobin，MB)、脂蛋白复合物(lipoprotein complex，LPC)以及脂质过氧化物(lipid peroxide，LPO)的含量。

血清中炎症因子含量的测定采用酶联免疫吸附法测定各组大鼠于缺血再灌注后0、3、6、9、12、15 h各时间点血清中白介素(interleukin，IL)- 1、IL- 6及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性因子的含量。

骨骼肌细胞内线粒体能量代谢测定部分大鼠肢体骨骼肌组织标本经0.9%冷生理盐水洗净后用于制备骨骼肌细胞悬液，再应用荧光探针技术，提供通过JC- 1荧光染色对骨骼肌细胞的线粒体进行荧光染色标记，然后用流式细胞仪进行测定。通过比较荧光染色为红色的线粒体与荧光染色为绿色的线粒体两者之间的荧光强度，反映大鼠肢体骨骼肌细胞内线粒体的跨膜电位情况。并利用ATP 检测试剂盒绘制肌肉组织细胞线粒体ATP 含量标准曲线，计算线粒体ATP的含量。

统计学处理采用SPSS 20.0统计分析软件(美国IBM公司)进行处理；计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率(%)表示，组间比较采用χ2分析；P<0.05为差异有统计学意义。

结果

硫化氢对缺血再灌注所致骨骼肌破坏程度对照组大鼠在缺血再灌注损伤后肢体骨骼肌、肝脏、肺脏及肾脏组织内MB、LPO和LPC的含量均明显增高(MB：P骨骼肌=0.003，P肝脏=0.001，P肺脏=0.001，P肾脏=0.001；LPO：P骨骼肌=0.001，P肝脏=0.001，P肺脏=0.001，P肾脏=0.002；LPC：P骨骼肌=0.000，P肝脏=0.002，P肺脏=0.002，P肾脏=0.003)，而缺血再灌注时采用硫化氢处理可明显抑制MB、LPO及LPC的生成(MB：P骨骼肌=0.021，P肝脏=0.036，P肺脏=0.005；LPO：P骨骼肌=0.003，P肝脏=0.008，P肺脏=0.010，P肾脏=0.015；LPC：P骨骼肌=0.002，P肝脏=0.026，P肺脏=0.007，P肾脏=0.006)(表1～3)。

硫化氢对缺血再灌注大鼠血清炎性反应的影响大鼠下肢缺血再灌注可导致大鼠血清中IL- 1、IL- 6及TNF-α的含量均升高，并且随着时间推移，IL- 1、IL- 6及TNF-α含量升高呈递增趋势，且自3 h时各组间IL- 1、IL- 6及TNF-α含量差异有统计学意义(IL- 1：P3 h=0.019，P6 h=0.011，P9 h=0.009，P12 h=0.008，P15 h=0.002；IL- 6：P3 h=0.026，P6 h=0.009，P9 h=0.002，P12 h=0.002，P15 h=0.003；TNF-α：P3 h=0.002，P6 h=0.002，P9 h=0.005，P12 h=0.002，P15 h=0.003)。而缺血再灌注时采用硫化氢处理可明显抑制血清中 IL- 1、IL- 6及TNF-α的含量水平(IL-1：P3 h=0.035，P6 h=0.039，P9 h=0.012，P12h=0.005，P15 h=0.006；IL- 6：P3 h=0.042，P6 h=0.025，P9 h=0.023，P12h=0.006，P15 h=0.005；TNF-α：P3 h=0.005，P6 h=0.003，P9 h=0.022，P12h=0.005，P15 h=0.005)，随着时间推移，其抑制效果越明显(表4～6)。

表1 硫化氢对大鼠骨骼肌、肝脏、肺脏及肾脏中肌红蛋白水平的影响(n=20，-±s，nmol/mg)Table 1 Effects of hydrogen sulfide on myoglobin level in skeletal muscle，liver，lung，and kidney of rats(n=20，-±s，nmol/mg)

P1：假手术组与对照组比较；P2：实验组与对照组比较